強壮剤および位相性平滑筋におけるキナーゼ関連タンパク質（テルキン）のリン酸化

平滑筋ミオシン軽鎖キナーゼ（MLCK）の独立して発現するC末端ミオシン結合ドメインであるKRP（Telokin）は、2つの関連機能を持っていると報告されています。最初に、KRPはATPの存在下でミオシンフィラメントを安定化します（Shirinsky et al。、1993、J。Biol。Chem。268、16578-16583）。第二に、KRPはミオシン軽鎖リン酸化のレベルを調節できます。この後者の役割では、複数のメカニズムが提案されています。1つの仮説は、軽鎖リン酸化がミオシンのKRPとMLCKの直接的な競合により減少し、収縮が失われるということです。あるいは、KRPは、正体不明のメカニズムを介して、KRPリン酸化によっておそらく強化される方法でミオシン軽鎖脱リン酸化を加速します。ここでは、KRPが平滑筋における主要なリンタンパク質であることを実証し、比較アプローチを使用して、そのリン酸化が持続的な収縮およびフォルスコリン誘発性弛緩とどのように相関するかを調査します。先入導入動脈筋のフォルスコリン弛緩は、KRPリン酸化の増加をほとんど引き起こしませんでしたが、ホルボールエステルによる治療は収縮性の変化なしにKRPリン酸化のレベルを増加させました。ホルボールエステルは相性組織の収縮を誘発しませんが、KRPリン酸化のレベルは増加します。両方の組織からのKRPのホスホペプチドマップは、KRPのN末端領域内のリン酸化の複数の部位を明らかにしました。GizzardからのKRPのホスホペプチドマップは、アミノ末端および/または追加部位での不均一性と一致する動脈のKRPのリンマップよりも複雑でした。in vitroでのKRPリン酸化の分析を通じて、Ser12、Ser15、およびSer15がCAMP依存性タンパク質キナーゼ、マイトジェン活性化タンパク質（MAP）キナーゼ、およびグリコーゲンシンターゼキナーゼ3（GSK3）によってそれぞれリン酸化されることを発見しました。GSK3によるリン酸化は、MAPキナーゼによる前リン酸化に依存していました。これは、KRPの条件付きまたは階層的なリン酸化の最初の報告のようです。このような複数のリン酸化と一致するペプチドは、鳥類KRPのin vivoホスホペプチドマップで見つかりました。集合的に、利用可能なデータは、KRPのin vivoリン酸化状態と平滑筋における弛緩への影響との間に複雑な関係があることを示しています。

KRP (telokin), an independently expressed C-terminal myosin-binding domain of smooth muscle myosin light chain kinase (MLCK), has been reported to have two related functions. First, KRP stabilizes myosin filaments (Shirinsky et al., 1993, J. Biol. Chem. 268, 16578-16583) in the presence of ATP. Secondly, KRP can modulate the level of myosin light chain phosphorylation. In this latter role, multiple mechanisms have been suggested. One hypothesis is that light chain phosphorylation is diminished by the direct competition of KRP and MLCK for myosin, resulting in a loss of contraction. Alternatively, KRP, through an unidentified mechanism, accelerates myosin light chain dephosphorylation in a manner possibly enhanced by KRP phosphorylation. Here, we demonstrate that KRP is a major phosphoprotein in smooth muscle, and use a comparative approach to investigate how its phosphorylation correlates with sustained contraction and forskolin-induced relaxation. Forskolin relaxation of precontracted artery strips caused little increase in KRP phosphorylation, while treatment with phorbol ester increased the level of KRP phosphorylation without a subsequent change in contractility. Although phorbol ester does not induce contraction of phasic tissues, the level of KRP phosphorylation is increased. Phosphopeptide maps of KRP from both tissues revealed multiple sites of phosphorylation within the N-terminal region of KRP. Phosphopeptide maps of KRP from gizzard were more complex than those for KRP from artery consistent with heterogeneity at the amino terminus and/or additional sites. We discovered through analysis of KRP phosphorylation in vitro that Ser12, Ser15 and Ser15 are phosphorylated by cAMP-dependent protein kinase, mitogen-activated protein (MAP) kinase and glycogen synthase kinase 3 (GSK3), respectively. Phosphorylation by GSK3 was dependent upon prephosphorylation by MAP kinase. This appears to be the first report of conditional or hierarchical phosphorylation of KRP. Peptides consistent with such multiple phosphorylations were found on the in vivo phosphopeptide maps of avian KRP. Collectively, the available data indicate that there is a complex relationship between the in vivo phosphorylation states of KRP and its effects on relaxation in smooth muscle.