カルモジュリンはコネキシンと共局在し、ギャップジャンクションチャネルゲーティングで直接的な役割を果たします

化学ゲーティングにおける直接的なカルモジュリン（CAM）の役割は、卵母細胞で発現したCAM変異体とCAM-コネキシン標識法でテストされました。N末端EFハンドペアをC末端ペアの重複に置き換えることにより得られるCAM変異体であるCAMCCは、CX32チャネルの化学ゲーティング感度を大幅に増加させ、VJの感度を低下させました。これは、CAMCCがCX32の前に発現された場合にのみ発生し、CAMCCおよび拡張CAMが接合形成前にCX32と相互作用することを示唆しています。接合部および細胞質斑点での直接CAM-CX相互作用は、CX32をトランスフェクトしたHELA細胞および凍結除去マウス肝臓の共焦点免疫蛍光顕微鏡によって実証されました。これは、CX32-GFP（緑）およびCAM-RFP（赤）またはCX32-CFP（CYAN）およびCAM-YFP（黄色）融合タンパク質を共発現するHELA細胞で確認されました。重要なことに、これらの細胞はギャップジャンクションを形成しませんでした。対照的に、2つの融合タンパク質のうち1つ（CX32-GFP、CX32-CFP、CAM-RFPまたはCAM-YFP）の1つのみを発現するHeLa細胞は、接合部と非接合蛍光スポットの両方を明らかにしました。これらの細胞では、CAM-CX32の共局在は、CX32-GFPを発現する細胞のCAM-YFPまたはCAMを発現する細胞のCX32の二次免疫蛍光標識によって実証されました。CAM-CXの共局在は、凍結破壊レプリカ免疫ゴールド標識（FRIL）により、ラット肝臓ギャップジャンクションでさらに実証されました。

The direct calmodulin (CaM) role in chemical gating was tested with CaM mutants, expressed in oocytes, and CaM-connexin labeling methods. CaMCC, a CaM mutant with greater Ca-sensitivity obtained by replacing the N-terminal EF hand pair with a duplication of the C-terminal pair, drastically increased the chemical gating sensitivity of Cx32 channels and decreased their Vj sensitivity. This only occurred when CaMCC was expressed before Cx32, suggesting that CaMCC, and by extension CaM, interacts with Cx32 before junction formation. Direct CaM-Cx interaction at junctional and cytoplasmic spots was demonstrated by confocal immunofluorescence microscopy in HeLa cells transfected with Cx32 and in cryosectioned mouse liver. This was confirmed in HeLa cells coexpressing Cx32-GFP (green) and CaM-RFP (red) or Cx32-CFP (cyan) and CaM-YFP (yellow) fusion proteins. Significantly, these cells did not form gap junctions. In contrast, HeLa cells expressing only one of the two fusion proteins (Cx32-GFP, Cx32-CFP, CaM-RFP or CaM-YFP) revealed both junctional and non-junctional fluorescent spots. In these cells, CaM-Cx32 colocalization was demonstrated by secondary immunofluorescent labeling of Cx32 in cells expressing CaM-YFP or CaM in cells expressing Cx32-GFP. CaM-Cx colocalization was further demonstrated at rat liver gap junctions by Freeze-fracture Replica Immunogold Labeling (FRIL).