インフルエンザAウイルスのRNAポリメラーゼは、そのウイルスRNAプロモーターとの相互作用により安定化されます

インフルエンザウイルスのRNAポリメラーゼは、宿主細胞の感染中に分割されたRNAウイルスゲノムの転写と複製の原因です。ポリメラーゼ機能は、そのRNAプロモーターとの相互作用に厳密に依存していることが知られていますが、ビリオンRNA（VRNA）プロモーターがポリメラーゼを安定化するかどうかを調査する試みは以前に報告されていません。ここでは、VRNAプロモーターがポリメラーゼを熱不活性化から保護するかどうかをテストしました。ヒト腎臓293T細胞への発現プラスミドの過渡的なトランスフェクションにより、インフルエンザウイルスVRNAプロモーター配列がない場合、部分的に精製した組換えインフルエンザAウイルスRNAポリメラーゼを調製しました。ポリメラーゼは、添加されたvRNAがない場合、40度Cの熱不安定であることがわかりました。ただし、VRNAプロモーターの5 'と3'の両方の鎖が存在する場合、熱の不活性化から保護されていました。VRNAの能力を使用して酵素を熱不活性化から保護することにより、ポリメラーゼ結合のVRNAプロモーターの二次構造要件をテストするために使用された変異原性アプローチと併せて、新しいアッセイを確立しました。バインディングには、コルクスクリューモデルで示唆されているように、vRNAの5 'と3'端の両方にパンハンドル構造と局所ヘアピンループ構造の存在が必要でした。vRNAプロモーターとインフルエンザウイルスRNAポリメラーゼヘテロトリメリック複合体との相互作用は、複合体の特定の閉じた立体構造を支持する可能性が高いため、感染した細胞と分離ウイルスの両方のRNAポリメラーゼの安定性が確保されます。

The RNA polymerase of the influenza virus is responsible for the transcription and replication of the segmented RNA viral genome during infection of host cells. Polymerase function is known to be strictly dependent on interaction with its RNA promoter, but no attempts to investigate whether the virion RNA (vRNA) promoter stabilizes the polymerase have been reported previously. Here we tested whether the vRNA promoter protects the polymerase against heat inactivation. We prepared partially purified recombinant influenza A virus RNA polymerase, in the absence of influenza virus vRNA promoter sequences, by transient transfection of expression plasmids into human kidney 293T cells. The polymerase was found to be heat labile at 40 degrees C in the absence of added vRNA. However, it was protected from heat inactivation if both the 5' and 3' strands of the vRNA promoter were present. By using the ability of vRNA to protect the enzyme against heat inactivation, we established a novel assay, in conjunction with a mutagenic approach, that was used to test the secondary structure requirement of the vRNA promoter for polymerase binding. Binding required a panhandle structure and the presence of local hairpin loop structures in both the 5' and 3' ends of vRNA, as suggested by the corkscrew model. The interaction of the vRNA promoter with the influenza virus RNA polymerase heterotrimeric complex is likely to favor a particular closed conformation of the complex, thereby ensuring the stability of the RNA polymerase within both the infected cell and the isolated virus.