ミトコンドリア脱共役タンパク質1遺伝子の上流エンハンサーにおけるCREB結合タンパク質およびNFE2L2転写因子の調節モチーフ

哺乳類における寒冷暴露に対する熱発生は、ミトコンドリアの脱共役タンパク質（UCP1）を介して茶色の脂肪組織（BAT）で発生します。UCP1遺伝子の発現は茶色の脂肪細胞で一意であり、しっかりと調節されています。マウスUCP1遺伝子の5'フランク領域には、PPRE、TRE、およびBAT固有のエンハンサー要素を備えた4つのハーフサイトCAMP応答性要素（CRE）を含むCIS作用要素が含まれています。これらのハーフサイトCREがUCP1発現にどのように関与しているかを分析する過程で、NF-E2のDNA調節要素がCRE2を重複させることがわかりました。電気泳動移動度シフトアッセイとCRE2要素を使用した競合アッセイは、BAT、in径脂肪、および後腹膜脂肪組織からの核タンパク質が特定の方法でCRE2モチーフ（CGTCA）と相互作用することを示しています。CRE結合タンパク質（CREB）に対する抗体を使用したスーパーシフトアッセイは、CRE2およびBATの核抽出物からの複合体に対する特定の親和性を示しています。さらに、ホスホクレブ/ATF1のウエスタンブロット分析は、ノルエピネフリン治療後のHIB-1B細胞におけるCREB/ATF1のリン酸化の増加を示しています。ルシフェラーゼレポーターコンストラクトを使用した一時的なトランスフェクションアッセイはまた、2つのハーフサイトCREがノルエピネフリンとcAMPに応答してUCP1の転写調節に関与していることを示しています。また、NF-E2の2番目のDNA調節要素がCre2領域の上流に位置することも示しています。この要素は、ヒトおよびげっ歯類のUCP1遺伝子の5'隣接領域の同様の場所にあり、茶色脂肪からの核抽出物を使用した電気泳動移動度シフトアッセイにより、ラットとヒトNF-E2への特異的結合を示しています。NFE2L2発現ベクターとUCP1エンハンサー領域のルシフェラーゼレポーターコンストラクトを使用した同時トランスフェクションは、NFE2L2がCAMPを介したシグナル伝達によりUCP1の調節に関与しているという追加の証拠を提供します。

Thermogenesis against cold exposure in mammals occurs in brown adipose tissue (BAT) through mitochondrial uncoupling protein (UCP1). Expression of the Ucp1 gene is unique in brown adipocytes and is regulated tightly. The 5'-flanking region of the mouse Ucp1 gene contains cis-acting elements including PPRE, TRE, and four half-site cAMP-responsive elements (CRE) with BAT-specific enhancer elements. In the course of analyzing how these half-site CREs are involved in Ucp1 expression, we found that a DNA regulatory element for NF-E2 overlaps CRE2. Electrophoretic mobility shift assay and competition assays with the CRE2 element indicates that nuclear proteins from BAT, inguinal fat, and retroperitoneal fat tissue interact with the CRE2 motif (CGTCA) in a specific manner. A supershift assay using an antibody against the CRE-binding protein (CREB) shows specific affinity to the complex from CRE2 and nuclear extract of BAT. Additionally, Western blot analysis for phospho-CREB/ATF1 shows an increase in phosphorylation of CREB/ATF1 in HIB-1B cells after norepinephrine treatment. Transient transfection assay using luciferase reporter constructs also indicates that the two half-site CREs are involved in transcriptional regulation of Ucp1 in response to norepinephrine and cAMP. We also show that a second DNA regulatory element for NF-E2 is located upstream of the CRE2 region. This element, which is found in a similar location in the 5'-flanking region of the human and rodent Ucp1 genes, shows specific binding to rat and human NF-E2 by electrophoretic mobility shift assay with nuclear extracts from brown fat. Co-transfections with an Nfe2l2 expression vector and a luciferase reporter construct of the Ucp1 enhancer region provide additional evidence that Nfe2l2 is involved in the regulation of Ucp1 by cAMP-mediated signaling.