乳腺腺癌（MTLN3）細胞におけるBcl-2によるドキソルビシン誘発ミトコンドリア機能障害およびアポトーシスの微分調節

さまざまな抗がん剤がアポトーシスに関連してミトコンドリアの摂動を引き起こします。ここでは、ドキソルビシン誘発性ミトコンドリア摂動とアポトーシスにおけるカスパーゼおよびBcl-2依存性経路の関与を調査しました。この目的のために、乳癌細胞株Mtln3におけるドキソルビシンによって引き起こされるアポトーシスにおけるミトコンドリアの関与を​​評価するために、ローダミン123、アネキシンV-アロフィコシアニン、およびヨウ化プロピジウムを使用して、新しい3色フローサイトメトリーアッセイを設定しました。ドキソルビシン誘発アポトーシスの前には、CD95およびCD95Lのアップレギュレーションと、ホスファチジルセリンの外部化の前に発生するミトコンドリア膜電位（デルタプシ）の崩壊が前に行われました。Deltapsiのこの低下は、ベンジルオキシカルボニルval-ala-dl-asp-fluoromethylketoneがそれを阻害しなかったため、カスパーゼ活性とは無関係でした。ベンジルオキシカルボニル-val-ala-dl-asp-フルオロメチルケトンもカスパーゼ-8の活性化をブロックし、したがって、デルタプシ散逸におけるデス受容体経路の関与を除外しました。さらに、MTLN3細胞におけるBcl-2の過剰発現はアポトーシスを阻害しましたが、デルタプシの散逸がまだ観察されました。エトポシド誘発アポトーシスを受けている細胞では、デルタプシの減少は観察されませんでした。細胞間でのデルタプシとシトクロムCの局在の免疫蛍光分析は、デルタプシとシトクロムCの放出の崩壊が、正常およびBCL-2過剰発現細胞の両方で相互に独立していることを示しています。一緒に、これらのデータは、ミトコンドリア膜電位のドキソルビシン誘発散逸がホスファチジルセリンの外部化に先行し、カスパーゼまたはBcl-2制御のチェックポイントとは無関係であることを示しています。

Various anticancer drugs cause mitochondrial perturbations in association with apoptosis. Here we investigated the involvement of caspase- and Bcl-2-dependent pathways in doxorubicin-induced mitochondrial perturbations and apoptosis. For this purpose, we set up a novel three-color flow cytometric assay using rhodamine 123, annexin V-allophycocyanin, and propidium iodide to assess the involvement of the mitochondria in apoptosis caused by doxorubicin in the breast cancer cell line MTLn3. Doxorubicin-induced apoptosis was preceded by up-regulation of CD95 and CD95L and a collapse of mitochondrial membrane potential (Deltapsi) occurring prior to phosphatidylserine externalization. This drop in Deltapsi was independent of caspase activity, since benzyloxycarbonyl-Val-Ala-dl-Asp-fluoromethylketone did not inhibit it. Benzyloxycarbonyl-Val-Ala-dl-Asp-fluoromethylketone also blocked activation of caspase-8, thus excluding an involvement of the death receptor pathway in Deltapsi dissipation. Furthermore, although overexpression of Bcl-2 in MTLn3 cells inhibited apoptosis, dissipation of Deltapsi was still observed. No decrease in Deltapsi was observed in cells undergoing etoposide-induced apoptosis. Immunofluorescent analysis of Deltapsi and cytochrome c localization on a cell-to-cell basis indicates that the collapse of Deltapsi and cytochrome c release are mutually independent in both normal and Bcl-2-overexpressing cells. Together, these data indicate that doxorubicin-induced dissipation of the mitochondrial membrane potential precedes phosphatidylserine externalization and is independent of a caspase- or Bcl-2-controlled checkpoint.