MDCK細胞はヒトMDR1遺伝子をトランスフェクトしていますか？ヒト腸粘膜の良いモデルですか？

目的：ヒトMDR1遺伝子（MDCK-MDR1）をトランスフェクトしたMadin-Darby犬細胞がヒト腸粘膜の良いモデルであるかどうかを調査する。 方法：CACO-2細胞におけるP糖タンパク質（P-GP）発現は、ウエスタンブロッティング方法を使用したMDCK野生型（MDCK-WT）およびMDCK-MDR1細胞のP-GP発現と比較しました。MDCK-MDRI細胞、MDCK-WT細胞、およびCACO-2細胞におけるP-GPの偏光排出活性を、ジゴキシンを基質として使用して比較しました。これら3つの細胞株におけるビンブラスチンの流出のための見かけのミカリス - メンテン定数（K（M）、VMAX）が決定されました。P-gpの既知の基質/阻害剤の見かけの阻害定数（K（I））は、CACO-2またはMDCK-MDR1細胞単層のジゴキシンの流出に対する効果を測定することにより決定されました。 結果：MDCK-MDR1細胞は、ウエスタンブロットによって推定されるように、CACO-2およびMDCK-WT細胞と比較してより高いレベルのP-gpを発現しました。P-gpの2つのアイソフォームは、150 kDaおよび170 kDaの分子量で移動するCACO-2およびMDCK細胞で発現しました。MDCK-MDR1細胞では、150 kDaアイソフォームが過剰発現しているように見えました。MDCK-MDR1細胞は、CACO-2およびMDCK-WT細胞よりも[3H] - ジゴキシンの偏光排出量を示しました。CACO-2におけるビンブラスチンのk（m）値。MDCK-WT、およびMDCK-MDR1細胞はそれぞれ89.2 +/- 26.1、24.5 +/- 1.1、および252.8 +/- 134.7 MicroMでしたが、VMAX値は1.77 +/- 0.22、0.42 +/- 0.01、および2.43でした。+/- 0.86 pmolcm（-2）s（-1）。既知のP-gp基質/阻害剤は、一般に、MDCK-MDR1細胞よりもCACO-2細胞におけるジゴキシン排出の阻害のk（I）値が低いことを示しました。 結論：これらのデータは、MDCK-MDR1細胞がP-gpの150 kDaアイソフォームを過剰発現することを示唆しています。MDCK-MDR1細胞は、薬物および薬物候補のP-GP基質活性をスクリーニングするための有用なモデルです。ただし、MDCK-MDR1細胞モデルで決定された基質の見かけの速度論定数と親和性は、CACO-2細胞で得られた値とは異なる場合があります。基質活性のこれらの違いは、CACO-2およびMDCK-MDR1細胞における総P-GPの相対発現レベルの違い、および/またはこれら2つの細胞膜二重層への基質の分配の違いに起因する可能性があります。

PURPOSE: To investigate whether Madin-Darby canine kidney cells transfected with the human MDR1 gene (MDCK-MDR1) are a good model of the human intestinal mucosa. METHODS: P-glycoprotein (P-gp) expression in Caco-2 cells was compared with P-gp expression in MDCK wild- type (MDCK-WT) and MDCK-MDR1 cells using Western blotting methods. The polarized efflux activities of P-gp(s) in MDCK-MDRI cells, MDCK-WT cells, and Caco-2 cells were compared using digoxin as a substrate. Apparent Michaelis-Menten constants (K(M),Vmax) for the efflux of vinblastine in these three cell lines were determined. Apparent inhibition constants (K(I)) of known substrates/inhibitors of P-gp were determined by measuring their effects on the efflux of digoxin in Caco-2 or MDCK-MDR1 cell monolayers. RESULTS: MDCK-MDR1 cells expressed higher levels of P-gp compared to Caco-2 and MDCK-WT cells, as estimated by Western blots. Two isoforms of P-gp were expressed in Caco-2 and MDCK cells migrating with molecular weights of 150 kDa and 170 kDa. In MDCK-MDR1 cells, the 150 kDa isoforms appeared to be overexpressed. The MDCK-MDR1 cells exhibited higher polarized efflux of [3H]-digoxin than did Caco-2 and MDCK-WT cells. K(M) values of vinblastine in Caco-2. MDCK-WT, and MDCK-MDR1 cells were 89.2+/-26.1, 24.5+/-1.1, and 252.8+/-134.7 microM, respectively, whereas Vmax values were 1.77+/-0.22, 0.42+/-0.01, and 2.43+/-0.86 pmolcm(-2)s(-1), respectively. Known P-gp substrates/inhibitors showed, in general, lower K(I) values for inhibition of digoxin efflux in Caco-2 cells than in MDCK-MDR1 cells. CONCLUSIONS: These data suggest that the MDCK-MDR1 cells overexpress the 150 kDa isoform of P-gp. MDCK-MDR1 cells are a useful model for screening the P-gp substrate activity of drugs and drug candidates. However, the apparent kinetics constants and affinities of substrates determined in the MDCK-MDR1 cell model may be different than the values obtained in Caco-2 cells. These differences in substrate activity could result from differences in the relative expression levels of total P-gp in Caco-2 and MDCK-MDR1 cells and/or differences in the partitioning of substrates into these two cell membrane bilayers.