モノマーストレプトアビジンの設計、生産、特性評価と、ビオチン化タンパク質の親和性精製のためのその応用

ビオチン化タンパク質の可逆的親和性精製のためにストレプトアビジン - ビオチン技術の適用を拡大するために、発現宿主として亜種を使用してモノマーストレプトアビジンの新規形態を操作および生成しました。わずか2つのアミノ酸残基（T90およびD128）をアラニンに変化させることにより、結果として得られる変異体ストレプトアビジンと指定されたDM3を、分泌を介して可溶性官能タンパク質として単量体形態で100％産生されました。それはビオチンの存在下または非存在下で単量体状態にとどまりました。精製されたモノマーストレプトアビジンとビオチンとの相互作用は、表面プラズモン共鳴ベースのバイアコアバイオセンサーによって研究されました。そのオンレートは、モノマーアビジンのそれに匹敵しますが、そのオフレートは7倍低いです。解離定数は、1.3 x 10（-8）mであると判断されました。これらの特性により、ビオチン化タンパク質の親和性精製の魅力的な薬剤になります。固定化されたDM3ムテインを備えたアフィニティマトリックスを調製し、粗抽出物からビオチン化シトクロムCを精製するために適用しました。ビオチン化シトクロムCは、1つのステップで均一性に精製される可能性があり、完全な生物学的活性を保持することが示されました。ビオチン化タンパク質の精製における他の従来の方法よりもDM3ムテインを使用することの利点について説明します。

To expand the application of the streptavidin-biotin technology for reversible affinity purification of biotinylated proteins, a novel form of monomeric streptavidin was engineered and produced using Bacillus subtilis as the expression host. By changing as little as two amino acid residues (T90 and D128) to alanine, the resulting mutant streptavidin designated DM3 was produced 100% in the monomeric form as a soluble functional protein via secretion. It remained in the monomeric state in the presence or absence of biotin. Interaction of purified monomeric streptavidin with biotin was studied by surface plasmon resonance-based BIAcore biosensor. Its on-rate is comparable to that of monomeric avidin while its off-rate is seven times lower. The dissociation constant was determined to be 1.3 x 10(-8)M. These properties make it an attractive agent for affinity purification of biotinylated proteins. An affinity matrix with immobilized DM3 mutein was prepared and applied to purify biotinylated cytochrome c from a crude extract. Biotinylated cytochrome c could be purified to homogeneity in one step and was shown to retain full biological activity. Advantages of using DM3 mutein over other traditional methods in the purification of biotinylated proteins are discussed.