リン酸緩衝液システムでの凍結融解中のpH変化とタンパク質の安定性に対するグリシンの影響

以前の研究では、凍結中の可溶性バッファー成分の選択的沈殿が凍結濃縮物の有意なpHシフトを誘導する可能性があることが確立されています。リン酸ナトリウム溶液の凍結中、二節塩の結晶化は、タンパク質の安定性に劇的に影響を与える可能性のある3つのpHユニットと同じようにpH減少を生成する可能性があります。私たちの研究の目的は、医薬品タンパク質製剤で一般的に使用されるバルキング剤であるグリシン（0〜500 mm）の存在が、リン酸ナトリウム緩衝液で凍結中に通常観察されるpH変化にどのように影響し、これらのpH変化が変化するかどうかを判断する方法を決定することでした。グリシン/リン酸製剤におけるモデルタンパク質の不安定性に寄与します。リン酸ナトリウム緩衝液中の凍結中、グリシンの存在はpHに著しく影響しました。低濃度のグリシン（<OR = 50 mM）は、おそらく塩の核生成速度を減らし、それにより緩衝塩塩結晶化の程度を減少させることにより、10および100 mMのリン酸ナトリウム緩衝液で通常観察されるpHの減少を抑制しました。リン酸ナトリウム緩衝液中のより高い濃度（> 100 mM）でのグリシンの存在は、平衡値に近い凍結pH値によって示されるように、ディスディウム塩のより完全な結晶化をもたらしました（pH 3.6）。高濃度のグリシンはより多くの緩衝塩塩の結晶化を促進する可能性がありますが、これらのpHシフトは潜在的にタンパク質に損傷を与える可能性がありますが、グリシンはそのアモルファス状態でも、優先除外メカニズムを介してタンパク質を安定化するように作用する可能性があります。

Previous studies have established that the selective precipitation of a less soluble buffer component during freezing can induce a significant pH shift in the freeze concentrate. During freezing of sodium phosphate solutions, crystallization of the disodium salt can produce a pH decrease as great as 3 pH units which can dramatically affect protein stability. The objective of our study was to determine how the presence of glycine (0-500 mM), a commonly used bulking agent in pharmaceutical protein formulations, affects the pH changes normally observed during freezing in sodium phosphate buffer solutions and to determine whether these pH changes contribute to instability of model proteins in glycine/phosphate formulations. During freezing in sodium phosphate buffers, the presence of glycine significantly influenced the pH. Glycine at the lower concentrations (< or = 50 mM) suppressed the pH decrease normally observed during freezing in 10 and 100 mM sodium phosphate buffer, possibly by reducing the nucleation rate of salt and thereby decreasing the extent of buffer salt crystallization. The presence of glycine at higher concentration (> 100 mM) in the sodium phosphate buffer resulted in a more complete crystallization of the disodium salt as indicated by the frozen pH values closer to the equilibrium value (pH 3.6). Although high concentrations of glycine can facilitate more buffer salt crystallization and these pH shifts may prove to be potentially damaging to the protein, glycine, in its amorphous state, can also act to stabilize a protein via the preferential exclusion mechanism.