免疫蛍光染色および緑色蛍光タンパク質タグ付けによるヒマイン含有真核生物開始因子5Aの細胞内局在

真核生物開始因子5A（EIF-5A）は、デオキシヒプシンシンターゼとデオキシヒプシンヒドロキシラーゼによって翻訳後に形成される異常なアミノ酸残基である催眠術を含む唯一のタンパク質です。EIF-5A遺伝子は細胞の生存と増殖に不可欠ですが、eIF-5aの正確な機能と局在は不明のままです。この研究では、間接免疫蛍光染色および緑色蛍光タンパク質がeIF-5a（GFP-EIF5A）にタグ付けした緑色蛍光タンパク質の直接視覚化により、eIF-5aの細胞内分布を決定しました。ホルムアルデヒド固定細胞の免疫蛍光染色は、核と細胞質の両方にEIF-5Aが存在することを示しました。核EIF-5Aのみがトリトン抽出に耐性がありました。生細胞におけるGFPにタグ付けされたeIF-5aの直接視覚化は、同じ全細胞分布パターンを明らかにしました。しかし、GFP-EIF-5Aへの追加のピルビン酸キナーゼ（PK）部分の融合により、GFP-PK-EIF-5A融合タンパク質の核局在が妨げられました。GFP-PKタグの融合とeIF-5Aの3つの異なるドメインとの融合は、融合タンパク質の核局在化を明らかにすることもできず、受容体を介した核輸入の欠如を示唆しています。種間ヘテロカリオン融合アッセイを使用して、GFP-EIF-5aのGFP-REVの核輸出を検出できました。EIF-5Aの全細胞分布パターンは、エネルギーの枯渇、熱ショック、転写、翻訳、ポリアミン合成、またはCRM1依存性の核輸出の阻害を含む治療法に経験がありました。まとめて、我々のデータは、EIF-5Aが受動的拡散を介して核侵入を獲得することを示していますが、活性核細胞質シャトリングを受けていません。

Eukaryotic initiation factor 5A (eIF-5A) is the only protein in nature that contains hypusine, an unusual amino acid residue formed posttranslationally by deoxyhypusine synthase and deoxyhypusine hydroxylase. Although the eIF-5A gene is essential for cell survival and proliferation, the precise function and localization of eIF-5A remain unclear. In this study, we have determined the subcellular distribution of eIF-5A by indirect immunofluorescent staining and by direct visualization of green fluorescent protein tagged eIF-5A (GFP-eIF5A). Immunofluorescent staining of the formaldehyde-fixed cells showed that eIF-5A was present in both the nucleus and cytoplasm. Only the nuclear eIF-5A was resistant to Triton extraction. Direct visualization of GFP tagged eIF-5A in living cells revealed the same whole-cell distribution pattern. However, a fusion of an additional pyruvate kinase (PK) moiety into GFP-eIF-5A precluded the nuclear localization of GFP-PK-eIF-5A fusion protein. Fusion of the GFP-PK tag with three different domains of eIF-5A also failed to reveal any nuclear localization of the fusion proteins, suggesting the absence of receptor-mediated nuclear import. Using interspecies heterokaryon fusion assay, we could detect the nuclear export of GFP-Rev, but not of GFP-eIF-5A. The whole-cell distribution pattern of eIF-5A was recalcitrant to the treatments that included energy depletion, heat shock, and inhibition of transcription, translation, polyamine synthesis, or CRM1-dependent nuclear export. Collectively, our data indicate that eIF-5A gains nuclear entry via passive diffusion, but it does not undergo active nucleocytoplasmic shuttling.