血小板コラーゲン受容体糖タンパク質VI（GPVI）とコラーゲンとの相互作用の分析GPVIの二量体の形態は、線維性コラーゲンへの親和性を示しています

糖タンパク質VI（GPVI）は、コラーゲンと反応して血小板を活性化することが示されている血小板特異的糖タンパク質です。その構造は最近、cDNAクローニングによって特定されました（Clemetson、J。M.、Polgar、J.、Magnenat、E.、Wells、T。N.、およびClemetson、K。J.（1999）J。Biol。Chem。274、29019-29024）。ただし、コラーゲンとGPVIの間の相互作用のメカニズムは、コラーゲンとGPVIの両方が不溶性分子であるため、詳細に分析されていません。この研究では、GPVIの細胞外ドメインを次のように可溶性形態として表現しました：単量体形態（GPVIEX）とヒト免疫グロブリンFCドメイン（GPVI-FC（2））と融合したGPVIの二量体型。精製されたGpViexは、強く阻害されたCustrelet凝集を強く阻害しましたが、コラーゲン関連のペプチドによって誘発されるように弱く阻害されただけです。ただし、GPVI-FC（2）のみであり、GPVIEXではなく、コラーゲン誘発性血小板凝集を阻害しました。GPVIの二量体型は、酵素結合免疫吸着剤アッセイと表面プラズモン共鳴法の両方による固定化コラーゲンへのGPVI結合の測定から結論付けられたように、コラーゲンに対して高い親和性を示します。GPVI-FC（2）は、5.76 x 10（-7）mの解離定数（k（d））を伴う固定化コラーゲンの表面に結合しましたが、Gpviexの結合は弱すぎてこのパラメーターの推定を許可できませんでした。CVXは、コラーゲンへの二量体GPVIの結合を阻害しませんでした。これは、GPVIのコラーゲンへの結合部位がCVXとは異なることを示しています。まとめると、我々のデータは、コラーゲンの高親和性結合部位がGPVIの2つの鎖から構成されていることを示しています。さらに、CVXの結合部位はコラーゲン結合部位とは異なり、2つのGPVI分子によって形成される必要がないことを示唆しています。Dimeric Gpviは繊維性コラーゲンに対する高い親和性を示す唯一の形態であるため、我々の結果は、GPVIが血小板に二量体の形として存在することを示しています。さらに、表面のプラズモン共鳴は、可溶性コラーゲンとGPVIの間に検出可能な相互作用がないことを示し、GPVIが繊維状コラーゲンとのみ反応するという以前の観察を支持しました。

Glycoprotein VI (GPVI) is a platelet-specific glycoprotein that has been indicated to react with collagen and activate platelets. Its structure was recently identified by cDNA cloning (Clemetson, J. M., Polgar, J., Magnenat, E., Wells, T. N., and Clemetson, K. J. (1999) J. Biol. Chem. 274, 29019-29024). However, the mechanism of the interaction between collagen and GPVI has not been analyzed in detail because both collagen and GPVI are insoluble molecules. In this study, we expressed the extracellular domain of GPVI as soluble forms as follows: the monomeric form (GPVIex) and the dimeric form of GPVI fused with the human immunoglobulin Fc domain (GPVI-Fc(2)). Purified GPVIex strongly inhibited convulxin (Cvx)-induced platelet aggregation but only weakly inhibited that induced by collagen-related peptide. However, only GPVI-Fc(2), and not GPVIex, inhibited collagen-induced platelet aggregation. The dimeric form of GPVI exhibits high affinity for collagen, as concluded from measurements of GPVI binding to immobilized collagen by both the enzyme-linked immunosorbent assay and surface plasmon resonance methods. GPVI-Fc(2) bound to the surface of immobilized collagen with a dissociation constant (K(D)) of 5.76 x 10(-7) m, but the binding of GPVIex was too weak to allow estimation of this parameter. Cvx did not inhibit the binding of dimeric GPVI to collagen, indicating that the binding site of GPVI to collagen was different from that to Cvx. Taken together, our data indicate that the high affinity binding site for collagen is composed from two chains of GPVI. Furthermore, they suggest that the binding sites for Cvx are different from the collagen-binding sites and do not need to be formed by two GPVI molecules. Because dimeric GPVI is the only form that shows high affinity to fibrous collagen, our results indicate that GPVI would be present as a dimeric form on the platelet. Moreover, surface plasmon resonance indicated that there is no detectable interaction between soluble collagen and GPVI, supporting our previous observation that GPVI only reacts with fibrous collagen.