エノイル-CoAヒドラターゼの立体化学に対する突然変異誘発の効果

エノイル-CoAヒドラターゼは、トランス-2-クロトニル-CoAの水分補給を、3（s）-Hb-coA、3（s） - ヒドロキシブチリル-CoAと400000の立体特異性（k（s）/k（r））とともに触媒します。1 [Wu、W。J.、Feng、Y.、He、X.、Hofstein、H。S.、Raleigh、D。P.、およびTonge、P。J.（2000）J。Am。化学。Soc。122、3987-3994]。活性部位の触媒グルタミン酸塩の1つであるE164の置換は、アスパラギン酸またはグルタミンのいずれかで、3（r）の形成速度に影響を与えることなく、3産物エナンチオマー（k（s））の形成速度が低下します。製品（K（R））。その結果、K（S）/K（R）は、E164DとE164Qでそれぞれ1000および0.33です。対照的に、2番目の触媒グルタミン酸であるE144の突然変異誘発は、両方の製品エナンチオマーの形成速度を低下させます。したがって、3（r）-Hb-Coa、3（r） - ヒドロキシブチリル-CoAの形成にはE144のみが必要です。アルファプロトンの為替レートの分析と、アルファプロトンの酸性度が10000倍減少し、3（R） - ヒドロキシブチリル-CoA形成のメカニズムをサポートする基質類似体であるクロトニルオキシコアを使用した実験とともに、モデリング研究をモデリングします。E144触媒は、活性部位のS-Transの立体構造に結合するクロトニルCoAに水を段階的に添加しました。最後に、G141およびA98のバックボーンアミド基によって提供されるオキシアニオン穴の水素結合は、両方の製品エナンチオマーの形成にとって重要であることを実証します。

Enoyl-CoA hydratase catalyzes the hydration of trans-2-crotonyl-CoA to 3(S)-HB-CoA, 3(S)-hydroxybutyryl-CoA with a stereospecificity (k(S)/k(R)) of 400000 to 1 [Wu, W. J., Feng, Y., He, X., Hofstein, H. S., Raleigh, D. P., and Tonge, P. J. (2000) J. Am. Chem. Soc. 122, 3987-3994]. Replacement of E164, one of the catalytic glutamates in the active site, with either aspartate or glutamine reduces the rate of formation of the 3(S) product enantiomer (k(S)) without affecting the rate of formation of the 3(R) product (k(R)). Consequently, k(S)/k(R) is 1000 and 0.33 for E164D and E164Q, respectively. In contrast, mutagenesis of E144, the second catalytic glutamate, reduces the rate of formation of both product enantiomers. Thus, only E144 is required for the formation of 3(R)-HB-CoA, 3(R)-hydroxybutyryl-CoA. Modeling studies together with analysis of alpha-proton exchange rates and experiments with crotonyl-oxyCoA, a substrate analogue in which the alpha-proton acidity has been reduced 10000-fold, support a mechanism of 3(R)-hydroxybutyryl-CoA formation that involves the E144-catalyzed stepwise addition of water to crotonyl-CoA which is bound in an s-trans conformation in the active site. Finally, we also demonstrate that hydrogen bonds in the oxyanion hole, provided by the backbone amide groups of G141 and A98, are important for the formation of both product enantiomers.