シーケンス間隔転写因子結合部位の変更による合成哺乳類プロモーターライブラリの生成

異なる特定の活性を持つ合成哺乳類プロモーターのセットの開発について説明します。ライブラリは、ウイルスSV40初期プロモーターとヒトベータ - アクチンおよびユビキチンCプロモーターの断片から構築された200 bpキメラプロモーターとして構築された合成プロモーターJETに基づいています。ジェットプロモーターは、含まれたコンセンサスボックスを野生型プロモーターに見られる塩基対の距離で分離し、転写因子の相互作用を維持することによって作成されました。得られたプロモーターは、レポーターの発現を強化された緑色蛍光タンパク質と分泌されたアルカリホスファターゼレポーターアッセイの高レベルに駆動することが示されました。転写因子結合部位を同じ長さのランダム化された配列に分離する配列を置き換えることにより、細胞培養における10倍の転写活性にまたがる異なる強度の新しいプロモーターのセットが得られました。ライブラリ内の各プロモーターの測定された活性は、HIB5およびARPE-19細胞培養でテストされた場合、非常に特異的で再現性がありました。

The development of a set of synthetic mammalian promoters with different specific activities is described. The library is based on a synthetic promoter, JeT, constructed as a 200 bp chimeric promoter built from fragments of the viral SV40 early promoter and the human beta-actin and ubiquitin C promoters. The JeT promoter was made by separating the included consensus boxes by the same distances in base pairs as found in the wild-type promoters, thus preserving transcription factor interaction. The resulting promoter was shown to drive reporter expression to high levels in enhanced green fluorescent protein and secreted alkaline phosphatase reporter assays. By replacing sequences separating the transcription factor binding sites with randomized sequences of the same length, sets of new promoters with different strengths, spanning a 10-fold range of transcriptional activity in cell culture, was obtained. The measured activity of each promoter in the library was highly specific and reproducible when tested in HiB5 and ARPE-19 cell culture.