アミノ酸残基特異的安定同位体標識の定量的プロテオミクス

質量分析（MS）によるタンパク質定量の効率と精度を改善するために、さまざまな安定同位体標識（SIL）技術が最近浮上しています。安定した同位体タグ付きアミノ酸を細胞の成長中に残基特異的な方法で細胞タンパク質に組み込むための質量タグ戦略を開発しました。この研究では、この残基特異的SILアプローチをさらに、さまざまな細胞集団のタンパク質存在量の正確な定量化に拡張します。正常培地で成長した細胞で発現レベルが同じであるタンパク質の場合、正常（光）および標識（重い）同位体ピークの相対領域は、細胞の混合比と直線的に相関しています。このアプローチは、最初に酵母プロテオームに対する亜鉛応答性転写因子Zap1の効果を決定するために使用されました。ページゲルからの10個のタンパク質スポットをランダムに選択し、野生型およびZAP1DELTA細胞におけるそれらの微分タンパク質発現レベルは、同位体比によって容易に決定されました。メチオニンシンターゼ（MET6）は、ZAP1DELTA変異株で4回以上アップレギュレートされていることが確認されましたが、他の9つのタンパク質の発現レベルは変化しませんでした。さらに、この戦略を適用して、ヒト皮膚線維芽細胞の放射線に対する細胞反応を研究しました。SDS-PAGEからランダムに選択された1つのタンパク質バンドを分析すると、新規タンパク質の発現レベルは放射線に応答して2倍増加することがわかりましたが、対照タンパク質の発現レベルは変化しませんでした。この戦略は、タンパク質の相対存在量を正確に定量化するために、特定のタイプのアミノ酸を標識前駆体として使用して一般に適用可能です。

Various stable isotope labeling (SIL) techniques have recently emerged to improve the efficiency and accuracy of protein quantitation by mass spectrometry (MS). We have developed a mass-tagging strategy to incorporate stable isotope tagged amino acids into cellular proteins in a residue-specific manner during cell growth. In this study, we further extend this residue-specific SIL approach to the accurate quantitation of protein abundances in different cell populations. For proteins whose expression levels are the same in cells grown in the normal and labeled media, the relative areas of the normal (light) and labeled (heavy) isotopic peaks are linearly correlated with the cells mixing ratios. This approach was first used to determine the effect of the zinc-responsive transcription factor Zap1 on the yeast proteome. Ten protein spots from a PAGE gel were chosen randomly and their differential protein expression levels in wild-type and zap1delta cells were readily determined by the isotopic ratio. Methionine synthase (Met6) was identified to be up-regulated more than four times in the zap1delta mutant strain whereas the expression level of other nine proteins remained unchanged. Further, we applied this strategy to study the cellular response to radiation in human skin fibroblast cells. Analyzing one protein band randomly selected from SDS-PAGE, the expression level of a novel protein was found to increase two-fold in response to radiation whereas the expression level of a control protein remained unchanged. This strategy is generally applicable using any particular type of amino acid as the labeling precursors for accurate quantitation of protein relative abundances.