組換え免疫グロブリンG4モノクローナル抗体の完全なジスルフィド結合割り当て

組換えモノクローナル抗体（mAb）は、新たな治療領域です。ただし、組換えMABのジスルフィド結合の割り当てに関する報告はほとんどありません。この研究は、組換え免疫グロブリンG4（IgG4）mAbの完全なジスルフィド結合割り当てについて説明しています。N-エチルマレイミド（NEM）を使用して、mAbに存在する遊離スルフヒドリル基をマスクしました。ジスルフィドスクランブルなしのエンドプロテイナーゼLys-CによるMABの消化は、塩酸塩（GUHCL）のNEMの存在下でmAbを変性させることにより達成されました。その後、Lys-C DigestはDithiothreitol（DTT）で減少しました。ネイティブおよび減少したLYS-Cダイジェストは、オンライン逆位相高速液体クロマトグラフィー質量分析（RP-HPLC/MS）によって質量分析されました。ジスルフィド含有ペプチドは、接続性を検証するためのオフラインのナノエレクトロスプレー四重極四重極四肢質量分析（Nanoesi-QTOF MS）およびN末端Edmanシーケンスによって配列決定されました。組換えIgG4 mAbは、提案された方法との予想されるジスルフィド結合を含むことがわかった。NEMアルキル化試薬は、mAbの変性と消化中のジスルフィドスクランブルを最小限に抑える上で重要でした。MSとN末端のEdmanシーケンスを組み合わせたこの統合アプローチは、IgG4 mAbのジスルフィドパターンを迅速かつ完全に割り当てることができ、複数のジスルフィド結合を持つ他のmabおよび大タンパク質のジスルフィド結合の割り当てと構造分析に適用できるはずです。

Recombinant monoclonal antibodies (mAbs) are an emerging therapeutic area. However, there are few reports on disulfide bond assignment of recombinant mAbs. This work describes the complete disulfide bond assignment of a recombinant immunoglobulin G4 (IgG4) mAb. N-ethylmaleimide (NEM) was used to mask free sulfhydryl groups present in the mAb. Digestion of the mAb with endoproteinase Lys-C without disulfide scrambling was achieved by denaturing the mAb in the presence of NEM in guanidine hydrochloride (GuHCl). The Lys-C digest was subsequently reduced with dithiothreitol (DTT). Native and reduced Lys-C digests were mass analyzed by on-line reversed-phase-high-performance liquid chromatography mass spectrometry (RP-HPLC/MS). Disulfide-containing peptides were sequenced by off-line nanoelectrospray quadrupole time-of-flight mass spectrometry (nanoESI-QTOF MS) and N-terminal Edman sequencing for verifying connectivities. The recombinant IgG4 mAb was found to contain the expected disulfide linkages with the proposed method. The NEM alkylating reagent was critical in minimizing disulfide scrambling during the denaturation and digestion of the mAb. This integrated approach, combining MS and N-terminal Edman sequencing, was capable of assigning the disulfide pattern of the IgG4 mAb rapidly and completely, and should be applicable for disulfide bond assignment and structural analysis of other mAbs and large proteins with multiple disulfide bonds.