キモトリプシンによる特定の基質の加水分解のアロステリック活性化

ビス第四級窒素を有するさまざまなアゾベンゼン化合物は、アロステリック機構によって特定の特定の基質のキモトリプシンによる加水分解を促進することが示されています。最も強力な 2,2'-ビス[α-(ベンジルジメチルアンモニウム)メチル]アゾベンゼン ジブロミド (2,2'-QBzl) は、グルタリル-L-フェニルアラニン p-ニトロアニリドの加水分解を飽和濃度で 40 倍加速しました。加速は、Km を変更せずに kcat を増加することによって行われました。アセチル-L-チロシン p-ニトロアニリドおよびアセチル-L-チロシンアニリドの加水分解もQ-Bzlによって加速されました（それぞれ25倍および1.8倍）が、ヘモグロビン、アゾコールおよび多くのエステルの加水分解は影響を受けませんでした。塩化ジフェニルカルバミルおよびフッ化ジフェニルカルバミルによるキモトリプシンの不活化は、2,2'-Q-Bzlにより促進されました。NH 2 OH の存在下でも再反応は加速されましたが、求核剤の添加 (つまり NH 2 OH) が存在しない場合、速度の増加は検出できませんでした。アロステリックエフェクターは、2,2'-ビス[α-(o-ブロモメチルベンジルジメチルアンモニウム)メチル]アゾベンゼンジブロミドとの反応によりキモトリプシノーゲンAに共有結合しました。この生成物は、活性酵素に変換されると、加水分解のkcatが増加した結果、キモトリプシンよりも約4倍活性が高かった。kmは影響を受けませんでした。アロステリック加速プロセスのメカニズムは不明ですが、酵素のアシル化に影響を受けるすべての基質が律速であるため、エフェクターが「電荷リレーシステム」に対する誘導効果によって脱離基へのプロトン移動を促進することが暫定的に示唆されています。スペクトル研究により、アロステリック部位は水の極性に近い極性を持つ酵素の一部であり、おそらく酵素分子の外側表面にあることが示されています。

A variety of azobenzene compounds having bis-quaternary nitrogens have been shown to accelerate the hydrolysis by chymotrypsin of certain specific substrates by an allosteric mechanism. One of the most potent, 2,2'-bis[alpha-(benzyldimethylammonium)methyl]azobenzene dibromide (2,2'-QBzl) accelerated the hydrolysis of glutaryl-L-phenylalanine p-nitroanilide 40-fold at saturating concentration. Acceleration was by increasing kcat without altering Km. The hydrolysis of acetyl-L-tyrosine p-nitroanilide and acetyl-L-tyrosine anilide was also accelerated by Q-Bzl (25-fold and 1.8-fold respectively) while the hydrolysis of hemoglobin, azocoll and a number of esters was not affected. The inactivation of chymotrypsin by diphenylcarbamyl chloride and diphenylcarbamyl fluoride was accelerated by 2,2'-Q-Bzl. Reac;ivation in the presence of NH2OH was also accelerated, but in the absence of added nucleophile (i.e. of NH20H) no increase in rate was detectable. An allosteric effector was covalently attached to chymotrypsinogen A by reaction with 2,2'-bis[alpha-(o-bromomethylbenzyldimethylammonium)methyl]azobenezene dibromide. The product, when converted to active enzyme, was about 4 times more active than chymotrypsin as a result of an increase in kcat of hydrolysis; Km was unaffected. The mechanism of the allosteric acceleration process is not known but, because for all of the substrates affected acylation of the enzyme is rate-limitimg, it is tentatively suggested that the effectors facilitate proton transfer to the leaving group by an inductive effect on the 'charge relay system'. Spectral studies indicate that the allosteric site is a portion of the enzyme with a polarity near that of water, possibly on the outside surface of the enzyme molecule.