お茶の葉からのベータプリメベロシダーゼのクローニング、茶香りの重要な酵素

TEA（Camellia sinensis）植物のベータプリメベロシダーゼは、さまざまなアロマ化合物を解放するために、ベータプリメベロシド（6-O-beta-d-キシラノシルベータ - ベータ-d-グルコピラノシド）のアロマ前駆体を加水分解するユニークなディスクガル特異的グリコシダーゼです。そして、酵素は、製造プロセス中のウーロン茶と紅茶の花の香りの形成に深く関心を持っています。ベータプリメベロシダーゼは、緑茶の栽培品種の新鮮な葉から精製され（C. sinensis var sinensis cv yabukita）、その部分的なアミノ酸配列が決定されました。ベータプリメベロシダーゼcDNAは、縮退したオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、CV YabukitaのcDNAライブラリーから分離されています。cDNAインサートは、28アミノ酸残基と479-アミノ酸成熟タンパク質のN末端シグナルペプチドからなるポリペプチドをコードします。ベータプリメベロシダーゼタンパク質配列は、さまざまな植物のベータグルコシダーゼと50％から60％同一であり、1グリコシル加水分解酵素科に分類されました。大腸菌で発現したベータプリメベロシダーゼの成熟した形態は、ベータプリメベロシドを加水分解してプライムベロースユニットとアグリコンを解放することができましたが、2-フェニルエチルベータ-D-グルコピラノシドには作用しませんでした。これらの結果は、ベータプリメベロシダーゼがベータプリメベロシドを基質として選択的に認識し、特異的に二糖とアグリコンの間のベータグリコシド結合を加水分解することを示しています。ベータプリメベロシダーゼによる2-フェニルエチルベータプリメベロシドの酵素加水分解の立体化学に続いて、（1）H核磁気共鳴分光法が続き、酵素がリテンメカニズムによってベータプリメベロシドを加水分解することを明らかにしました。茶植物における防御メカニズムにおけるベータプリメベロシダーゼの役割と、茶製造プロセス中の花の香りの形成についても説明します。

A beta-primeverosidase from tea (Camellia sinensis) plants is a unique disaccharide-specific glycosidase, which hydrolyzes aroma precursors of beta-primeverosides (6-O-beta-D-xylopyranosyl-beta-D-glucopyranosides) to liberate various aroma compounds, and the enzyme is deeply concerned with the floral aroma formation in oolong tea and black tea during the manufacturing process. The beta-primeverosidase was purified from fresh leaves of a cultivar for green tea (C. sinensis var sinensis cv Yabukita), and its partial amino acid sequences were determined. The beta-primeverosidase cDNA has been isolated from a cDNA library of cv Yabukita using degenerate oligonucleotide primers. The cDNA insert encodes a polypeptide consisting of an N-terminal signal peptide of 28 amino acid residues and a 479-amino acid mature protein. The beta-primeverosidase protein sequence was 50% to 60% identical to beta-glucosidases from various plants and was classified in a family 1 glycosyl hydrolase. The mature form of the beta-primeverosidase expressed in Escherichia coli was able to hydrolyze beta-primeverosides to liberate a primeverose unit and aglycons, but did not act on 2-phenylethyl beta-D-glucopyranoside. These results indicate that the beta-primeverosidase selectively recognizes the beta-primeverosides as substrates and specifically hydrolyzes the beta-glycosidic bond between the disaccharide and the aglycons. The stereochemistry for enzymatic hydrolysis of 2-phenylethyl beta-primeveroside by the beta-primeverosidase was followed by (1)H-nuclear magnetic resonance spectroscopy, revealing that the enzyme hydrolyzes the beta-primeveroside by a retaining mechanism. The roles of the beta-primeverosidase in the defense mechanism in tea plants and the floral aroma formation during tea manufacturing process are also discussed.