精製牛肝臓NADPH-Cytochrome P450レダクターゼの生化学的特性

シトクロムP450依存性モノオキシゲナーゼ系の義務成分であるNADPH-シトクロムP450レダクターゼは、牛肝臓ミクロソームからの電気泳動均一性に精製されました。精製手順には、第1および2番目のDEAEセルロースカラムの洗剤溶解ミクロソームのイオン交換クロマトグラフィーが含まれ、2 '、5'-ADPセファロースアフィニティクロマトグラフィーが続きました。酵素のさらなる濃度とEmulgen 913および2'-AMPの除去は、最終的なヒドロキシラパタイトカラムで達成されました。酵素は239倍精製され、収量は13.5％でした。酵素のモノマー分子量は、SDS-PAGEにより76000 +/- 3000（n = 5）と推定されました。牛肉レダクターゼの絶対吸収スペクトルは、455および378 nmで2つのピークを示し、肩は478 nmのフラボタンパク質の特性を示しました。酵素活性に対するシトクロムC濃度、pH、およびイオン強度の効果を研究しました。酵素によるシトクロムCの還元はMichaelis-Menten速度論に続き、精製酵素の見かけのK（M）は、0.3 Mリン酸カリウム緩衝液（PH 7.7）で酵素活性を測定した場合、シトクロムCの47.7マイクロームであることがわかりました。シトクロムCレダクターゼ活性の安定性は、20％グリセロールの存在下および非存在下で25度および37度Cで調べられました。グリセロールの存在は、両方の温度でのシトクロムC還元酵素活性の安定性を高めました。ヒツジ肺ミクロソームシトクロムP4502BおよびNADPH-シトクロムP450レダクターゼも、私たちの研究室で開発された既存の方法によって精製されました。牛肝臓と羊の肺レダクターゼの両方が、精製されたヒツジ肺シトクロムP4502Bと合成脂質、ホスファチジルコリンジラウロイルを含む再構成されたシステムにおけるベンズフェタミンとコカインN-デメチル化反応を支えるのに効果的であることがわかった。

NADPH-cytochrome P450 reductase, an obligatory component of the cytochrome P450 dependent monooxygenase system, was purified to electrophoretic homogeneity from beef liver microsomes. The purification procedure involved the ion exchange chromatography of the detergent-solubilized microsomes on first and second DEAE-cellulose columns, followed by 2',5'-ADP Sepharose affinity chromatography. Further concentration of the enzyme and removal of Emulgen 913 and 2'-AMP were accomplished on the final hydroxylapatite column. The enzyme was purified 239-fold and the yield was 13.5%. Monomer molecular weight of the enzyme was estimated to be 76000 +/- 3000 (N = 5) by SDS-PAGE. The absolute absorption spectrum of beef reductase showed two peaks at 455 and 378 nm, with a shoulder at 478 nm, characteristics of flavoproteins. The effects of cytochrome c concentration, pH, and ionic strength on enzyme activity were studied. Reduction of cytochrome c with the enzyme followed Michaelis-Menten kinetics, and the apparent K(m) of the purified enzyme was found to be 47.7 microM for cytochrome c when the enzyme activity was measured in 0.3 M potassium phosphate buffer (pH 7.7). Stability of cytochrome c reductase activity was examined at 25 and 37 degrees C in the presence and absence of 20% glycerol. The presence of glycerol enhanced the stability of cytochrome c reductase activity at both temperatures. Sheep lung microsomal cytochrome P4502B and NADPH-cytochrome P450 reductase were also purified by the already existing methods developed in our laboratory. Both beef liver and sheep lung reductases were found to be effective in supporting benzphetamine and cocaine N-demethylation reactions in the reconstituted systems containing purified sheep lung cytochrome P4502B and synthetic lipid, phosphatidylcholine dilauroyl.