シアノバクテリアにおけるRNAポリメラーゼのすべてのSigma因子の精製、特性評価、および遺伝子発現

RNAポリメラーゼ（RNAP）Sigma因子遺伝子とタンパク質の発現は、単細胞シアノバクテリウムSynechocystis sp。PCC 6803、光合成を実行できます。すべての9つのSigma因子（グループ1、SIGA、グループ2、SIGBからSIGEへ、およびグループ3、SIGFからSIGI）および各RNAPコアサブユニット（RPOA、RPOB、RPOC1、RPOC2）は、大腸菌細胞から過剰生産および精製され、次にポリクローナルから精製されました。抗体が調製されました。ウエスタンブロットおよびプライマーの拡張分析により、グループ1および2 Sigma因子の細胞内レベルは、定常状態の成長条件下で総タンパク質のマイクログラムあたり0.9 FMOLから9.3 FMOLの範囲であり、成長相依存性または構成転写産物が観察されたことが明らかになりました。。興味深いことに、通常の生理学的条件下ではグループ3シグマ因子タンパク質は検出されませんでしたが、その転写産物は堅牢であり、翻訳減衰および/またはタンパク質の不安定性の調節の可能性を意味します。また、系統解析により、シアノバクテリアのグループ3シグマ因子ホモログは、それらの間の進化的または機能的な発散とともに保存されていることが明らかになりました。in vitroおよびin vivoの結果は、高照度応答性SIGD発現の重要な証拠と、光合成遺伝子、PSBAのそのプロモーター認識の重要な証拠を示しています。一方、自己調節SIGB転写、熱ショックへの細胞の暴露時にSIGB発現が劇的に増加したこと、および熱ショックHSPAプロモーター上の他のSigma因子の冗長性を伴うSIGBによる特定のプロモーター認識が観察されました。これらの発見は、SIGBがヒートショック応答性のSigma因子であることを明確に示しています。ここでは、関連するSigma因子遺伝子のユニークなプロモーターアーキテクチャと発現についても説明します。

The expression of RNA polymerase (RNAP) sigma factor genes and proteins was characterized as a first step toward understanding their functions in a unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803, which can perform photosynthesis. All nine sigma factors (group 1, SigA; group 2, SigB to SigE; and group 3, SigF to SigI) and each RNAP core subunit (RpoA, RpoB, RpoC1 and RpoC2) were overproduced and purified from Escherichia coli cells, then polyclonal antibodies were prepared. Western blot and primer extension analyses revealed that the intracellular levels of group 1 and 2 sigma factors ranged from 0.9 fmol to 9.3 fmol per microgram of the total protein under conditions of steady-state growth, and that growth phase-dependent or constitutive transcripts were observed. Interestingly, no group 3 sigma factor proteins were detected under normal physiological conditions whereas their transcripts were robust, implying a possible regulation of translational attenuation and/or protein instability. Phylogenetic analysis also revealed that group 3 sigma factor homologues of cyanobacteria are conserved with evolutionary or functionary divergence among them. In vitro and in vivo results indicated significant evidence of high-light responsive SigD expression and its promoter recognition of the photosynthesis gene, psbA. On the other hand, autoregulated sigB transcription, a dramatically increased SigB expression upon the exposure of cells to heat-shock, and specific promoter recognition by SigB with redundancy of other sigma factors on the heat-shock hspA promoter were observed. These findings clearly indicated that SigB is a heat-shock responsive sigma factor. The unique promoter architecture and expression of the relevant sigma factor gene are also discussed herein.