3 'IGH規制領域の下流の境界の解明

クラススイッチの組換え（CSR）は、可変領域遺伝子セグメントを変更せずに、IgMからIgG、IgA、またはIgEへのB細胞の免疫グロブリン重鎖（IGH）定数領域遺伝子（C（H））を変化させます。このプロセスには、CSRを標的とするC（H）遺伝子の上流に位置するスイッチ領域を介した転写が必要です。これは、C（H）遺伝子座の3 '末端で特徴付けられていない調節領域の活性に依存するプロセス（3'（3」IGH RR）これは、遺伝子座に挿入されたPGK-Neoカセットの効果を介して関係しています。最も3 'C（H）遺伝子（CA）の下流の30kb領域には、HS3A、HS1,2、HS3B、およびHS4を含む4つの既知のエンハンサー要素が含まれています。近位2つのエンハンサー要素（HS3AまたはHS1,2）のいずれかをPGK-NEO遺伝子カセットに置き換え、ほとんどのC（H）遺伝子の生殖細胞転写およびCSRを破壊しました。ただし、エンハンサーのいずれかをLOXPシーケンスに置き換えると、CSRにはこれらの要素がCSRにとって重要ではないことを示しています。C（H）遺伝子座内のさまざまな部位でのPGK-NEOカセットの挿入は、CSRを上流に抑制しましたが、下流のC（H）遺伝子ではなく、PGK-Neoカセットの挿入が遺伝子座への短絡に挿入するという概念を支持します。挿入の上流の依存性C（H）遺伝子のCSRを促進する3 'RR。これらの分析は、3 'Iの重要な要素がHS1,2から下流であることも示しています。この研究では、3 '境界を定義することにより、3' Igh RRをローカライズしようとしました。この目的のために、PGK-NEO遺伝子カセットは、CSRを受ける正常な能力を持つESセルのHS4要素の2kBの下流をターゲットにしました。次に、RAG-2欠損胚盤胞補体を使用して、この突然変異のホモ接合性B細胞を抱くキメラマウスを生成しました。このようなキメラは、脾コンパートメントの正常な再構成を示し、正常な血清免疫グロブリンレベルを有していました。in vitroの活性化により、PGK-Neoカセットからの転写がB細胞で誘導されましたが、測定されたすべてのIGHアイソタイプに対するCSRは正常レベルで発生しました。これらの発見は、以前のPGK-NEO挿入研究と相まって、3 'Igh RRの重要な要素がHS4のHS1,2と2kBの下流の間の17kb領域内にあることを示唆しています。

Class switch recombination (CSR) changes the immunoglobulin heavy chain (IgH) constant region gene (C(H)) in B cells from IgM to IgG, IgA, or IgE, without modifying the variable region gene segment. This process requires transcription through switch (S) regions located upstream of the C(H) genes targeted for CSR, a process that relies on the activity of an uncharacterized regulatory region at the 3' end of the C(H) locus (3' IgH RR) that has been implicated via the effects of pgk-neo cassettes inserted into the locus. The 30kb region just downstream of the most 3' C(H) gene (Ca) contains four known enhancer elements including HS3a, HS1,2, HS3b, and HS4. Replacement of either of the proximal two enhancer elements (HS3a or HS1,2) with a pgk-neo gene cassette disrupted germline transcription of and CSR to most C(H) genes. However, replacement of either of the enhancers with a loxP sequence had no effect on CSR indicating that these elements are not critical for CSR. Insertion of a pgk-neo cassette at various sites within the C(H) locus inhibited CSR to upstream, but not downstream C(H) genes, supporting the notion that the pgk-neo cassette insertion into the locus short-circuits the ability of the 3' RR to facilitate CSR of dependent C(H) genes upstream of the insertion. These analyses also indicated that the key elements of the 3' IgH RR were downstream from HS1,2. In this study, we have sought to localize the 3' IgH RR by defining its 3' boundary. For this purpose, a pgk-neo gene cassette was targeted 2kb downstream of the HS4 element in ES cells that had normal ability to undergo CSR. We then employed Rag-2 deficient blastocyst complementation to generate chimeric mice that harbored B cells homozygous for this mutation. Such chimeras exhibited normal reconstitution of the splenic compartment and had normal serum immunoglobulin levels. Upon in vitro activation, transcription from the pgk-neo cassette was induced in B cells, however, CSR to all measured IgH isotypes occurred at normal levels. These findings, coupled with previous pgk-neo insertion studies, suggest that key elements of the 3' IgH RR lie within a 17kb region between HS1,2 and 2kb downstream of HS4.