CHO細胞で発現するヒトノシセプチン受容体のアゴニスト誘発性の内在化と脱感作

この研究では、CHO-K1細胞で発現するクローン化されたヒトノシセプチン受容体（HNOP）のアゴニスト誘発性の内在化、リサイクル、およびシグナル伝達（cAMPレベルの測定）を調べました。内在化は、生存可能な細胞上の受容体結合アッセイによって証明されました。アゴニストノキセプチン/オルファニンFQ（NC）は、クラスリンおよびATP依存的にHNOP受容体の迅速な内在化を促進しました（細胞表面受容体の約78％が1ミクロムNCに2分曝露した後に失われました）。以前に報告したように、sk-n-be細胞では、内在化はより速く、Cho-K1細胞でマークされていました。この違いは、SK-N-BE細胞よりもCHO-K1で検出されたベータアレスチンアイソフォームの高いレベルに関連している可能性があります。HNOP受容体の内在化は部分的に可逆的であり、アゴニストの存在下でリサイクルが発生しました。受容体のリサイクルは、岡田酸感受性ホスファターゼに依存し、モネンシンによってブロックされました。共焦点顕微鏡分析により、CHO-K1細胞で発現するエピトープタグ付きHNOP受容体の原形質膜への内在化とリサイクルが確認されました。これらの受容体は、アゴニストの挑戦時に急速な脱感作を受けました。フォルスコリン刺激cAMP産生の阻害におけるNCの有効性は、曝露後10分後に大幅に減少し、受容体の内在化速度と相関していました。さらに、モネンシンによるHNOP受容体リサイクルの遮断は、この受容体のより長く、関連する脱感作を引き起こすことが観察されました。したがって、HNOP受容体の活性化、内在化、リサイクル間の動的サイクルは、細胞表面上のこの受容体の活性を決定します。

In this study, we examined agonist-induced internalization, recycling and signalling (measure of cAMP levels) of the cloned human nociceptin receptor (hNOP) expressed in CHO-K1 cells. Internalization was proven by a receptor-binding assay on viable cells. The agonist nociceptin/orphanin FQ (NC) promoted rapid internalization of the hNOP receptor (approximately 78% of cell surface receptors were lost after 2 min exposure to 1 microM NC) in a clathrin- and ATP-dependent manner. Internalization was more rapid and marked in CHO-K1 cells than, as we previously reported, in SK-N-BE cells. This difference may be related to higher levels of beta-arrestin isoforms detected in CHO-K1 than in SK-N-BE cells. hNOP receptor internalization was partially reversible and recycling occurred in the presence of the agonist; receptor recycling was dependent on okadaic acid-sensitive phosphatases and was blocked by monensin. Confocal microscopy analysis confirmed the internalization and the recycling back to the plasma membrane of an epitope-tagged hNOP receptor expressed in CHO-K1 cells. These receptors underwent rapid desensitization upon agonist challenge: NC efficacy in inhibiting forskolin-stimulated cAMP production was significantly reduced 10 min after exposure and correlated with the rate of receptor internalization. Moreover, we observed that blockade of hNOP receptor recycling by monensin would cause a more prolonged and relevant desensitization of this receptor. Thus, the dynamic cycle between hNOP receptor activation, internalization and recycling determines the activity of this receptor on the cell surface.