細胞培養におけるC型肝炎ウイルスRNA複製のウイルスおよび細胞の決定因子

C型肝炎ウイルス（HCV）の複製に関する研究は、驚くほど高いレベルでヒト肝腫細胞株HUH-7で複製する選択可能なサブ遺伝子レプリコンの開発によって促進されています。選択された細胞のレプリコン集団の分析により、RNA複製を大幅に促進する細胞培養適応変異の発生が明らかになりました。HCV細胞培養適応をよりよく理解するために、RNA複製に対する効果のために26個の独立したレプリコン細胞クローンの配列分析によって特定された保存された変異を特徴付けました。複製を促進する変異は、ほぼすべての非構造（NS）タンパク質で見られ、複製の効率と協同性に対する影響により、少なくとも2つのグループに細分化できます：（i）。複製に影響が低いNS3の変異は、高度に適応性のある突然変異と組み合わせると協力的に複製を強化しました。NS4B、-5A、および-5Bの変異は、複製の大幅な増加を引き起こしますが、互いに互換性がありません。適応変異に加えて、宿主細胞は効率的なRNA複製のために同様に重要な役割を果たすことがわかりました。同じHuh-7細胞株のいくつかの通路をテストし、レプリコン増幅をサポートする能力に最大100倍の違いが見つかりました。これらの違いは、内部リボソーム侵入部位依存性翻訳やRNA分解の変動によるものではありませんでした。HUH-7細胞の異なるレベルの許容性の原因となる可能性のある細胞因子の検索では、トランスフェクトレプリコンRNAの量が増加すると複製効率が低下することがわかりました。HUH-7細胞の細胞因子は、RNA増幅を制限します。要約すると、これらのデータは、細胞培養におけるHCV複製の効率が、ウイルス配列の適応と宿主細胞自体の両方によって決定されることを示しています。

Studies on the replication of hepatitis C virus (HCV) have been facilitated by the development of selectable subgenomic replicons replicating in the human hepatoma cell line Huh-7 at a surprisingly high level. Analysis of the replicon population in selected cells revealed the occurrence of cell culture-adaptive mutations that enhance RNA replication substantially. To gain a better understanding of HCV cell culture adaptation, we characterized conserved mutations identified by sequence analysis of 26 independent replicon cell clones for their effect on RNA replication. Mutations enhancing replication were found in nearly every nonstructural (NS) protein, and they could be subdivided into at least two groups by their effect on replication efficiency and cooperativity: (i). mutations in NS3 with a low impact on replication but that enhanced replication cooperatively when combined with highly adaptive mutations and (ii). mutations in NS4B, -5A, and -5B, causing a strong increase in replication but being incompatible with each other. In addition to adaptive mutations, we found that the host cell plays an equally important role for efficient RNA replication. We tested several passages of the same Huh-7 cell line and found up to 100-fold differences in their ability to support replicon amplification. These differences were not due to variations in internal ribosome entry site-dependent translation or RNA degradation. In a search for cellular factor(s) that might be responsible for the different levels of permissiveness of Huh-7 cells, we found that replication efficiency decreased with increasing amounts of transfected replicon RNA, indicating that viral RNA or proteins are cytopathic or that host cell factors in Huh-7 cells limit RNA amplification. In summary, these data show that the efficiency of HCV replication in cell culture is determined both by adaptation of the viral sequence and by the host cell itself.