プラスミド形質転換法を使用して大腸菌臨床株から発見された新しい制限酵素

細菌細胞における制限酵素の存在は、古典的なファージ制限修飾（R-M）テスト、直接in vitro酵素アッセイ、または最近の細菌ゲノム配列分析からのいずれかによって予測されています。プラスミドDNAの変換にファージR-Mテスト原理を適用し、プラスミドR-Mテストを確立しました。このテストを検証するために、ファージラムダDNAのBAMHIフラグメントを含む6つのプラスミドを構築し、I型（ECOBI、ECOAI、ECO124I）、タイプII（HINDIII）およびタイプIII（ECOP1I）を含む既知のR-Mシステムを含む大腸菌株に変換されました。単一の認識部位を持つプラスミドDNAは、変換の相対効率の低下を示しました（EOT = 10（-1）-10（-2））。複数の認識部位が存在すると、EOT値の大幅な減少が観察されました。細胞内で確立されると、プラスミドは修飾を受けました（EOT = 1.0）。このテストをE.COLI臨床株をスクリーニングし、93％（14/15）の細胞に制限酵素の存在を検出しました。追加のサブクローンとコンピュータープログラムであるRM検索を使用して、4つの新しい制限酵素、ECO377I、ECO585I、ECO646I、ECO777Iを特定しました。EcobiのイソキゾマーであるEco1158iは、この研究でも発見されました。

The presence of restriction enzymes in bacterial cells has been predicted by either classical phage restriction-modification (R-M) tests, direct in vitro enzyme assays or more recently from bacterial genome sequence analysis. We have applied phage R-M test principles to the transformation of plasmid DNA and established a plasmid R-M test. To validate this test, six plasmids that contain BamHI fragments of phage lambda DNA were constructed and transformed into Escherichia coli strains containing known R-M systems including: type I (EcoBI, EcoAI, Eco124I), type II (HindIII) and type III (EcoP1I). Plasmid DNA with a single recognition site showed a reduction of relative efficiency of transformation (EOT = 10(-1)-10(-2)). When multiple recognition sites were present, greater reductions in EOT values were observed. Once established in the cell, the plasmids were subjected to modification (EOT = 1.0). We applied this test to screen E.coli clinical strains and detected the presence of restriction enzymes in 93% (14/15) of cells. Using additional subclones and the computer program, RM Search, we identified four new restriction enzymes, Eco377I, Eco585I, Eco646I and Eco777I, along with their recognition sequences, GGA(8N)ATGC, GCC(6N)TGCG, CCA(7N)CTTC, and GGA(6N)TATC, respectively. Eco1158I, an isoschizomer of EcoBI, was also found in this study.