SV40ウイルスシーケンスなしのin vitroパッケージSV40ベクターの高いクローニング能力

組換えSV40カプシドタンパク質を使用したプラスミドDNAのin vitroパッケージングは​​、SV40配列の要件やパッケージ化できるDNAのサイズの制限など、他のSV40システムのいくつかの制限を克服する潜在的に有用な手順です。in vitroパッケージングシステムは、4つのSV40タンパク質（VP1、VP2、VP3、およびAGNO）またはVP1のみを使用しています。3つのABCトランスポーター遺伝子（MDR 1、MRP 1、またはMXR）によって薬剤耐性を付与する能力は、代理蛍光基質のローダミン-123またはカルセインAMおよびその特異的阻害剤を使用して、またはトランスポーターへの特定の抗体を使用して細胞を検出することにより決定しました。蛍光活性化細胞ソーター分析（FACS）による表面発現。緑色の蛍光タンパク質プラスミド（EGFP-C1）も使用され、遺伝子移動を監視しました。パッケージ化されたプラスミドのサイズは4.2から17.6 kbの範囲で、電子顕微鏡で決定されたようにわずかに影響を受けた粒子サイズのみでした。すべてのSV40タンパク質を使用して9.5 kbおよびより大きなプラスミドをパッケージ化した場合、MDR1発現はVP1単独と比較して減少しました。パッケージング後の15.2 kb DNAのサイズは、元のDNAと同じでした。in vitroでSV40 CapSIDタンパク質を使用したパッケージングは​​、SV40シーケンスを必要としません。MDR1またはGFP遺伝子のいずれかを使用して、細胞を低濃度でホルボール12-ミリスタ酸13-アセテート（PMA）で前処理した場合、発現が増強されることを示すことができました。インターフェロンガンマは発現を変えませんでした。in vitroパッケージは、以前に実現したよりも柔軟であり、ウイルスシーケンスを必要とせずに少なくとも17 kbのプラスミドDNAのパッケージを許可すると結論付けています。このシステムは、SV40ウイルスベクターの効率的な遺伝子送達と非ウイルスベクターの安全性の推定を組み合わせています。

In vitro packaging of plasmid DNA using recombinant SV40 capsid proteins is a potentially useful procedure that overcomes some restrictions of the other SV40 systems such as the requirement for SV40 sequences and the limitation in size of DNA that can be packaged. The in vitro packaging system uses the four SV40 proteins (VP1, VP2, VP3, and agno) or VP1 only. The ability to confer drug resistance by three ABC transporter genes (MDR 1, MRP 1, or MXR) was determined using the surrogate fluorescent substrates rhodamine-123 or calcein AM and their specific inhibitors, or by using specific antibodies to the transporters to detect cell surface expression by fluorescence-activated cell sorter analysis (FACS). A green fluorescent protein plasmid (EGFP-C1) was also used to monitor gene transfer. The packaged plasmids ranged in size from 4.2 to 17.6 kb, and only slightly affected particle size as determined by electron microscopy. When 9.5 kb and larger plasmids were packaged using all SV40 proteins, MDR1 expression was decreased compared to VP1 alone. The size of the 15.2 kb DNA after packaging was the same as the original DNA. Packaging with SV40 capsid proteins in vitro does not require any SV40 sequences. Using either the MDR1 or the GFP gene we could demonstrate enhanced expression when cells were pretreated with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) at low concentrations. Interferon-gamma did not alter expression. We conclude that in vitro packaging is more flexible then previously realized, permitting packaging of at least 17 kb plasmid DNA without the requirement for any viral sequences. This system combines efficient gene delivery of the SV40 viral vector with the presumed safety of nonviral vectors.