成長因子ベータ調節SMAD3とSMAD4タンパク質と孤児核受容体肝細胞核因子-4の間の転写クロストークのメカニズム

我々は、核受容体肝細胞核因子を結合するホルモン応答要素を介して肝細胞のアポリポタンパク質C-IIIプロモーターをトランステイブ化することで、形質転換成長因子ベータ（TGFBETA）がSMA-MAD（SMAD）タンパク質3およびSMAD4タンパク質を調節することを示しました。4（HNF-4）。本研究では、SMAD3とSMAD4は、in vitroおよびin vivoの両方でMADホモロジー1ドメインを介してHNF-4と物理的に相互作用するものではないことを示しています。SMADとHNF-4による標的プロモーターの相乗的トランス活性化は、特定のプロモーターコンテキストに依存することが示されており、SMADの無傷のベータヘアピン/DNA結合ドメインは必要ありませんでした。グルタチオンS-トランスフェラーゼ相互作用アッセイを使用して、HNF-4の2つの領域、N末端活性化関数1（AF-1）ドメイン（AA 1-24）およびC末端Fドメイン（AA 388-455）を確立しました。in vitroで物理SMAD3/HNF-4相互作用を媒介できます。in vivoでは、SMAD3およびSMAD4タンパク質は、AF-1および隣接するDNA結合ドメインを介してさまざまなGAL4-HNF-4融合タンパク質のトランス活性化機能を強化しましたが、AF-1からの単一のチロシンからアラニンの置換はSMADによる共活性化を廃止しました。調査結果は、TGFBETA調節SMADとHNF-4の間の転写クロストークが、2種類の転写因子の特定の機能的ドメインによって媒介されることを示唆しています。さらに、特定のターゲットプロモーターに対するこの相互作用の特異性は、TGFBETAおよびSMADによって規制されているさまざまな肝細胞機能において重要な役割を果たす可能性があります。

We have shown previously that the transforming growth factor-beta (TGFbeta)-regulated Sma-Mad (Smad) protein 3 and Smad4 proteins transactivate the apolipoprotein C-III promoter in hepatic cells via a hormone response element that binds the nuclear receptor hepatocyte nuclear factor 4 (HNF-4). In the present study, we show that Smad3 and Smad4 but not Smad2 physically interact with HNF-4 via their Mad homology 1 domains both in vitro and in vivo. The synergistic transactivation of target promoters by Smads and HNF-4 was shown to depend on the specific promoter context and did not require an intact beta-hairpin/DNA binding domain of the Smads. Using glutathione S-transferase interaction assays, we established that two regions of HNF-4, the N-terminal activation function 1 (AF-1) domain (aa 1-24) and the C-terminal F domain (aa 388-455) can mediate physical Smad3/HNF-4 interactions in vitro. In vivo, Smad3 and Smad4 proteins enhanced the transactivation function of various GAL4-HNF-4 fusion proteins via the AF-1 and the adjacent DNA binding domain, whereas a single tyrosine to alanine substitution in AF-1 abolished coactivation by Smads. The findings suggest that the transcriptional cross talk between the TGFbeta-regulated Smads and HNF-4 is mediated by specific functional domains in the two types of transcription factors. Furthermore, the specificity of this interaction for certain target promoters may play an important role in various hepatocyte functions, which are regulated by TGFbeta and the Smads.