タンパク質の芳香族遊離加水分解物の産生のための誘導体である新しい固定化安定化カルボキシペプチダーゼの設計

この論文では、タンパク質の制御された加水分解に使用される安定したカルボキシペプチダーゼA（CPA） - グリオキシル誘導体を示しています。それらは、架橋6％アガロースビーズに固定化安定化CPAを生成し、低濃度および高濃度のアルデヒド基で活性化し、異なる固定時間を活性化した。CPA-グリオキシル誘導体は、活性化反応物としてグルタルアルデヒドを使用して調製された他のアガロース誘導体と比較されました。最も安定化されたCPA-グリオキシル誘導体は、48時間の固定時間とサポートの高い活性化グレードを使用して生成されました。この誘導体は、可溶性酵素よりも約260倍安定性が高く、長鎖ペプチドの加水分解のために可溶性酵素の活性の約42％を示しました（例えば、チーズホエイタンパク質は、以前は固定化トリプシンおよびキモトリプシンと加水分解しました）および小さな基質N-ベンゾイルグリシル-L-フェニルアラニン（Hippuryl-L-PHE）。これらの結果は、従来のサポートであるグルタルアルデヒドアガロースを使用して達成された結果よりもはるかに優れていました。CPA（可溶性と固定化の両方）の酸加水分解の産物のアミノ酸分析により、約4つのリジン残基がグリオキシルアガロースビーズにリンクされていることが示され、酵素と支持の間に強いマルチポイント共有結合付着が存在することが示唆されました。加水分解の最大温度は、50度C（可溶性酵素）から70度C（最も安定したCPA-グリオキシル誘導体）に増加しました。最も安定したCPA-グリオキシル誘導体は、高温での長鎖ペプチドの加水分解に効率的に使用できます（例：60度C）。同じ動作条件下での可溶性酵素。この新しいCPA誘導体は、芳香族アミノ酸がないに違いないタンパク質加水分解物の産生において、このプロテアーゼを使用する可能性を大幅に増加させました。

This paper presents stable carboxypeptidase A (CPA)-glyoxyl derivatives, to be used in the controlled hydrolysis of proteins. They were produced after immobilizing-stabilizing CPA on cross-linked 6% agarose beads, activated with low and high concentrations of aldehyde groups, and different immobilization times. The CPA-glyoxyl derivatives were compared to other agarose derivatives, prepared using glutaraldehyde as activation reactant. The most stabilized CPA-glyoxyl derivative was produced using 48 h of immobilization time and high activation grade of the support. This derivative was approximately 260-fold more stable than the soluble enzyme and presented approximately 42% of the activity of the soluble enzyme for the hydrolysis of long-chain peptides (e.g., cheese whey proteins previously hydrolyzed with immobilized trypsin and chymotrypsin) and of the small substrate N-benzoylglycyl-l-phenylalanine (hippuryl-l-Phe). These results were much better than those achieved using the conventional support, glutaraldehyde-agarose. Amino acid analysis of the products of the acid hydrolysis of CPA (both soluble and immobilized) showed that approximately four lysine residues were linked on the glyoxyl agarose beads, suggesting the existence of an intense multipoint covalent attachment between the enzyme and the support. The maximum temperature of hydrolysis was increased from 50 degrees C (soluble enzyme) to 70 degrees C (most stable CPA-glyoxyl derivative). The most stable CPA-glyoxyl derivative could be efficiently used in the hydrolysis of long-chain peptides at high temperature (e.g., 60 degrees C), being able to release 2-fold more aromatic amino acids (Tyr, Phe, and Trp) than the soluble enzyme, under the same operational conditions. This new CPA derivative greatly increased the feasibility of using this protease in the production of protein hydrolysates that must be free of aromatic amino acids.