昆虫細胞で発現するヒトヘパラナーゼ（HPA1）タンパク質の活性ヘテロダイマー型の生化学的特性

哺乳類のエンドグリコシダーゼヘパラナーゼ（HPA1）は、主に細胞の基底膜に存在するヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）を切断する原因であり、細胞外マトリックス（ECM）をリモデリングする可能性は、胚発生および腫瘍腫瘍において重要である可能性があります。この酵素の発現の上昇は、腫瘍細胞増殖、転移、炎症、血管新生などのさまざまな病理学的プロセスに関係しています。したがって、酵素は潜在的な治療標的を表します。HPA1タンパク質は、最初は不活性な65 kDaプロエンザイムとして合成され、その後、タンパク質分解切断によって活性化され、8および50 kDAポリペプチドの活性ヘテロダイマーを生成すると考えられています。一連のHPA1欠失タンパク質の分析により、8 kDaサブユニットが酵素活性に不可欠であることを確認します。ここでは、高い特異的活性の大量の組換えタンパク質の生成に使用される昆虫細胞発現システムを初めて紹介します。個々のサブユニットをバシュロウイルス分泌ベクターにクローニングし、昆虫細胞に共発現しました。活性分泌されたヘテロダイマータンパク質を培地から回収し、1段階のヘパリンセファロースクロマトグラフィー手順によって分離して、タンパク質を> 90％の純度にしました。組換え酵素は、消化、基質切断特異性、および酸性pHの好みで解放されたHSフラグメントのサイズに関して、天然タンパク質と同様に振る舞いました。しかし、in vitroアッセイと細胞結合ヘパラン硫酸のin vivo分解の両方で測定されるように、生理学的pH値ではかなりの量の活性も検出できました。

The mammalian endoglycosidase heparanase (Hpa1) is primarily responsible for cleaving heparan sulphate proteoglycans (HSPGs) present on the basement membrane of cells and its potential for remodelling the extracellular matrix (ECM) could be important in embryonic development and tumour metastasis. Elevated expression of this enzyme has been implicated in various pathological processes including tumour cell proliferation, metastasis, inflammation and angiogenesis. The enzyme therefore represents a potential therapeutic target. Hpa1 protein is initially synthesized as an inactive 65 kDa proenzyme that is then believed to be subsequently activated by proteolytic cleavage to generate an active heterodimer of 8 and 50 kDa polypeptides. By analysis of a series of Hpa1 deletion proteins we confirm that the 8 kDa subunit is essential for enzyme activity. We present here for the first time an insect cell expression system used for the generation of large amounts of recombinant protein of high specific activity. Individual subunits were cloned into baculoviral secretory vectors and co-expressed in insect cells. Active secreted heterodimer protein was recovered from the medium and isolated by a one-step heparin-Sepharose chromatography procedure to give protein of >90% purity. The recombinant enzyme behaved similarly to the native protein with respect to the size of HS fragments liberated on digestion, substrate cleavage specificity and its preference for acidic pH. A significant amount of activity, however, was also detectable at physiological pH values, as measured both by an in vitro assay and by in vivo degradation of cell-bound heparan sulphate.