Staudinger Ligationを使用したDNAの部位固有の蛍光標識

高効率と高い選択性を備えたStaudinger Ligationを使用して、DNAの部位固有の蛍光標識を報告します。アジド基によって5 '端で修飾されたオリゴヌクレオチドは、5 - [（3'-ジフェニルホスフィニル-4'-メトキシカルボニル）フェニルカルボニル）アミノ酢酸）フルオレセイン（FAM）を選択して、FAM-標識条件を生成して、FAM-標識条件を産生しました。高収量のオリゴヌクレオチド（約90％）。蛍光オリゴヌクレオチドは、マトリックス支援レーザー脱着/イオン化時間照射時間質量分析（MALDI-TOF MS）によって特徴付けられました。Staudinger Ligationの収量が比較的高いため、サイズ排除クロマトグラフィーと脱塩による製品の単純な精製は、結果として得られる蛍光オリゴヌクレオチドがサンガーDIDEOXYシーケンス反応のプライマーとして使用して蛍光DNA伸長断片を生成するのに十分です。蛍光電気泳動DNAシーケンサーによって分析されます。結果は、Staudinger Ligationが蛍光オリゴヌクレオチドを調製してDNAシーケンス産物を生成するために、毛細血管の電気泳動DNAシーケンサーでの単一塩基分解能で検出されたDNAシーケンス産物を生成するために、正常かつ部位特異的に使用できることを示しています。

We report the site-specific fluorescent labeling of DNA using Staudinger ligation with high efficiency and high selectivity. An oligonucleotide modified at its 5' end by an azido group was selectively reacted with 5-[(N-(3'-diphenylphosphinyl-4'-methoxycarbonyl)phenylcarbonyl)aminoacetamido]fluorescein (Fam) under aqueous conditions to produce a Fam-labeled oligonucleotide with a high yield (approximately 90%). The fluorescent oligonucleotide was characterized by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). Because of the relatively high yield of the Staudinger ligation, simple purification of the product by size-exclusion chromatography and desalting is sufficient for the resulting fluorescent oligonucleotide to be used as a primer in a Sanger dideoxy sequencing reaction to produce fluorescent DNA extension fragments, which are analyzed by a fluorescent electrophoresis DNA sequencer. The results indicate that the Staudinger ligation can be used successfully and site-specifically to prepare fluorescent oligonucleotides to produce DNA sequencing products, which are detected with single base resolution in a capillary electrophoresis DNA sequencer using laser-induced fluorescence detection.