重複する一本鎖DNAオリゴヌクレオチドによる組換え：組換え中間体のテスト

大腸菌のin vivoでの染色体またはエピソーマDNAの高効率変異誘発、修復、およびエンジニアリングには、ファージラムダベースの組換えシステムを使用できます。ターゲットに対する短い隣接ホモロジーを備えた長い線形二本鎖DNAが組換えに使用される場合、ラムダEXO、ベータ、およびGAMタンパク質が必要です。現在のモデルは次のとおりです。（i）GAMは宿主のRECBCD活性を阻害し、それによって再結合のためにDNA基質を保護します。（ii）各DNAの端から5 ' - > 3'方向に分解し、3 '単一鎖DNA尾を持つ二本鎖DNAを作成します。（iii）ベータはこれらの3 'オーバーハングに結合して、それらを保護およびアニールして相補的なシーケンスにします。エレクトロポレーションを使用して、in vivoでアニールすると、EXOが作成すべき組換え中間体に近似する重複する相補的なオリゴヌクレオチドを導入することにより、このモデルを赤組換えのモデルをテストしました。この手法を使用して、Exoに依存しない組換えを見つけました。驚くべきことに、5 'オーバーハングがより効率的に再結合した同様に構築された基質。この5 'オーバーハング組換えには、高レベルの組換えにEXOとベータの両方が必要であり、2つのオリゴヌクレオチドは3'末端で6 bpのみオーバーラップする必要がありました。結果は、EXOが生成する3 'オーバーハングにベータをロードする可能性があることを示しています。さらに、複数の重複するオリゴヌクレオチドを使用して、多くの遺伝子工学手順に役立つことができる技術であるin vivoで組換えを生成するために成功裏に使用されました。

A phage lambda-based recombination system, Red, can be used for high-efficiency mutagenesis, repair, and engineering of chromosomal or episomal DNA in vivo in Escherichia coli. When long linear double-stranded DNA with short flanking homologies to their targets are used for the recombination, the lambda Exo, Beta, and Gam proteins are required. The current model is: (i) Gam inhibits the host RecBCD activity, thereby protecting the DNA substrate for recombination; (ii) Exo degrades from each DNA end in a 5' --> 3' direction, creating double-stranded DNA with 3' single-stranded DNA tails; and (iii) Beta binds these 3' overhangs to protect and anneal them to complementary sequences. We have tested this model for Red recombination by using electroporation to introduce overlapping, complementary oligonucleotides that when annealed in vivo approximate the recombination intermediate that Exo should create. Using this technique we found Exo-independent recombination. Surprisingly, a similarly constructed substrate with 5' overhangs recombined more efficiently. This 5' overhang recombination required both Exo and Beta for high levels of recombination and the two oligonucleotides need to overlap by only 6 bp on their 3' ends. Results indicate that Exo may load Beta onto the 3' overhang it produces. In addition, multiple overlapping oligonucleotides were successfully used to generate recombinants in vivo, a technique that could prove useful for many genetic engineering procedures.