GGASおよびガンマアダプティンのCOOH末端付属ドメインのバインディングパートナー

アダプター付属ドメインは、コーティングされた小胞アクセサリタンパク質の結合プラットフォームとして機能すると考えられています。ブタの脳サイトゾルからのグルタチオンS-トランスフェラーゼプルダウンを使用して、AP-1ガンマサブユニットとGGASの両方の付属ドメイン、ガンマシュナーギンと2つの新規タンパク質、p56およびp200の両方の付属ドメインに結合できる3つのタンパク質を見つけます。P56はP200よりも優れた抗体を引き出し、一般により扱いやすいものでした。p56とガンマシュナーギンはin vitroでGGAとガンマの両方の付属物に結合しますが、ノコダゾール処理細胞の免疫蛍光標識は、P56がTGN46陽性膜上のGGAと共局在する一方で、ガンマ - シュイナーがAP-1と共局在する一方で、膜の膜締め切りにおいて主に主に主に共局在することを示しています。。さらに、AP-1欠損細胞では、p56は膜関連のままであるのに対し、ガンマ - synerginはサイトゾルになります。したがって、p56とガンマシュナーギンは、in vivoでそれぞれGGAとAP-1に対して非常に強い好みを示しています。ただし、GGAとガンマの付属物は、X線結晶学によって決定されたのと同じ倍率を共有しており、変異誘発は同じアミノ酸がそれらの結合部位に寄与することを明らかにしています。細胞内の野生型GGAおよびガンマ付属ドメインを過剰発現することにより、それぞれP56とガンマシュナーギンをサイトゾルに駆動でき、2つの経路を選択的に破壊する可能性のあるメカニズムを示唆しています。

The adaptor appendage domains are believed to act as binding platforms for coated vesicle accessory proteins. Using glutathione S-transferase pulldowns from pig brain cytosol, we find three proteins that can bind to the appendage domains of both the AP-1 gamma subunit and the GGAs: gamma-synergin and two novel proteins, p56 and p200. p56 elicited better antibodies than p200 and was generally more tractable. Although p56 and gamma-synergin bind to both GGA and gamma appendages in vitro, immunofluorescence labeling of nocodazole-treated cells shows that p56 colocalizes with GGAs on TGN46-positive membranes, whereas gamma-synergin colocalizes with AP-1 primarily on a different membrane compartment. Furthermore, in AP-1-deficient cells, p56 remains membrane-associated whereas gamma-synergin becomes cytosolic. Thus, p56 and gamma-synergin show very strong preferences for GGAs and AP-1, respectively, in vivo. However, the GGA and gamma appendages share the same fold as determined by x-ray crystallography, and mutagenesis reveals that the same amino acids contribute to their binding sites. By overexpressing wild-type GGA and gamma appendage domains in cells, we can drive p56 and gamma-synergin, respectively, into the cytosol, suggesting a possible mechanism for selectively disrupting the two pathways.