単純ヘルペスウイルスにおける再結合依存性DNA合成の再構成1

相同組換えによる二本鎖DNA休憩の修復は、ゲノムの安定性の維持に不可欠です。単純ヘルペスウイルス1では、ウイルス感染時に誘導されることが知られている酸化的損傷の部位での複製フォーク崩壊の結果として、二本鎖DNA休憩が発生する可能性があります。二本鎖DNA休憩は、ゲノム異性化中のエンドヌクレアーゼGによるウイルスAシーケンスの切断によっても生成されます。鎖浸潤がDNA合成と結合される精製タンパク質を使用してシステムを再構成しました。このシステムでは、ウイルス一本鎖DNA結合タンパク質は、単一鎖DNAの同種のスーパーコイルプラスミドへの同化を促進し、変位ループの形成をもたらします。侵入DNAの3 '末端は、ポリメラーゼやヘリカーゼプライマーゼを含むウイルスDNA複製タンパク質によって促進される長鎖DNA合成のプライマーとして機能します。侵入プライマーの効率的な拡張には、DNA緩和酵素（真核生物トポイソメラーゼIまたはDNAジャイラーゼ）も必要です。ウイルスポリメラーゼ自体はDNA合成には不十分であり、DNAリラックス酵素はウイルスヘリカーゼプライマーゼに代わるものではありません。浸潤プロセスにおけるその役割に加えて、ウイルスの一本鎖DNA結合タンパク質は、長鎖DNA合成にも必要です。トポロジー的に異なる、積極的にスーパーコイル化された変位ループであるフォームXは、DNA合成のテンプレートとしては機能しません。これらの観察結果は、再結合と複製が二本鎖切断を修復することによりウイルスゲノムの安定性を維持することに貢献するモデルをサポートしています。彼らはまた、in vivoでのウイルス複製中に観察された広範な分岐を説明しています。

The repair of double-strand DNA breaks by homologous recombination is essential for the maintenance of genome stability. In herpes simplex virus 1, double-strand DNA breaks may arise as a consequence of replication fork collapse at sites of oxidative damage, which is known to be induced upon viral infection. Double-strand DNA breaks are also generated by cleavage of viral a sequences by endonuclease G during genome isomerization. We have reconstituted a system using purified proteins in which strand invasion is coupled with DNA synthesis. In this system, the viral single-strand DNA-binding protein promotes assimilation of single-stranded DNA into a homologous supercoiled plasmid, resulting in the formation of a displacement loop. The 3' terminus of the invading DNA serves as a primer for long-chain DNA synthesis promoted by the viral DNA replication proteins, including the polymerase and helicase-primase. Efficient extension of the invading primer also requires a DNA-relaxing enzyme (eukaryotic topoisomerase I or DNA gyrase). The viral polymerase by itself is insufficient for DNA synthesis, and a DNA-relaxing enzyme cannot substitute for the viral helicase-primase. The viral single-strand DNA-binding protein, in addition to its role in the invasion process, is also required for long-chain DNA synthesis. Form X, a topologically distinct, positively supercoiled form of displacement-loop, does not serve as a template for DNA synthesis. These observations support a model in which recombination and replication contribute toward maintaining viral genomic stability by repairing double-strand breaks. They also account for the extensive branching observed during viral replication in vivo.