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クラスAベータラクタマーゼによるベータラクタム抗生物質の加水分解は、これらの薬剤に対する細菌耐性の一般的な原因です。ベータラクタマーゼ阻害タンパク質（BLIP）は、TEM-1ベータラクタマーゼやSME-1ベータラクタマーゼを含むいくつかのクラスAベータラクタマーゼを結合および阻害することができます。TEM-1およびSME-1酵素は、33％のアミノ酸配列同一性と同様の折り畳みを共有していますが、表面静電特性と、ブリップが結合するループヘリックス領域の立体構造が大きく異なります。これらの酵素のそれぞれに対する結合親和性に寄与するブリップ上の残基を特定するために、アラニン型変異誘発を実施しました。結果は、結合の配列要件が両方の酵素で類似していることを示しています。ブリップの表面に芳香族残基の2つのパッチによって提供される結合自由エネルギーのほとんどが類似しています。界面内のいくつかのセリンなどの極性残基は、どちらの酵素に対する親和性に大きな寄与しません。さらに、結合の特異性は、TEM-1.ブリップ複合体の構造に埋め込まれている2つの荷電残基Glu73とLys74の変異によって、および活性部位に挿入する2つのループにある残基によって大幅に変化します。ポケット。結果に基づいて、E73A/Y50A二重変異体が構築され、TEM-1対SME-1酵素の結合特異性に220,000倍の変化が示されました。
クラスAベータラクタマーゼによるベータラクタム抗生物質の加水分解は、これらの薬剤に対する細菌耐性の一般的な原因です。ベータラクタマーゼ阻害タンパク質（BLIP）は、TEM-1ベータラクタマーゼやSME-1ベータラクタマーゼを含むいくつかのクラスAベータラクタマーゼを結合および阻害することができます。TEM-1およびSME-1酵素は、33％のアミノ酸配列同一性と同様の折り畳みを共有していますが、表面静電特性と、ブリップが結合するループヘリックス領域の立体構造が大きく異なります。これらの酵素のそれぞれに対する結合親和性に寄与するブリップ上の残基を特定するために、アラニン型変異誘発を実施しました。結果は、結合の配列要件が両方の酵素で類似していることを示しています。ブリップの表面に芳香族残基の2つのパッチによって提供される結合自由エネルギーのほとんどが類似しています。界面内のいくつかのセリンなどの極性残基は、どちらの酵素に対する親和性に大きな寄与しません。さらに、結合の特異性は、TEM-1.ブリップ複合体の構造に埋め込まれている2つの荷電残基Glu73とLys74の変異によって、および活性部位に挿入する2つのループにある残基によって大幅に変化します。ポケット。結果に基づいて、E73A/Y50A二重変異体が構築され、TEM-1対SME-1酵素の結合特異性に220,000倍の変化が示されました。
The hydrolysis of beta-lactam antibiotics by class A beta-lactamases is a common cause of bacterial resistance to these agents. The beta-lactamase inhibitory protein (BLIP) is able to bind and inhibit several class A beta-lactamases, including TEM-1 beta-lactamase and SME-1 beta-lactamase. Although the TEM-1 and SME-1 enzymes share 33% amino acid sequence identity and a similar fold, they differ substantially in surface electrostatic properties and the conformation of a loop-helix region that BLIP binds. Alanine-scanning mutagenesis was performed to identify the residues on BLIP that contribute to its binding affinity for each of these enzymes. The results indicate that the sequence requirements for binding are similar for both enzymes with most of the binding free energy provided by two patches of aromatic residues on the surface of BLIP. Polar residues such as several serines in the interface do not make significant contributions to affinity for either enzyme. In addition, the specificity of binding is significantly altered by mutation of two charged residues, Glu73 and Lys74, that are buried in the structure of the TEM-1.BLIP complex as well as by residues located on two loops that insert into the active site pocket. Based on the results, a E73A/Y50A double mutant was constructed that exhibited a 220,000-fold change in binding specificity for the TEM-1 versus SME-1 enzymes.
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