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変異体スクリーニングは、胞子壁ジティロシンが不足しているSaccharomyces cerevisiaeの変異体を分離するように設計されています。電子顕微鏡で示されているように、ほとんどの変異体胞子には、胞子壁の最も外側のジティロシンが豊富な層のみが欠けていました。しかし、変異体DIT101には、胞子壁のキトサン層がさらに不足していました。化学測定により、この変異体は胞子形成中にキトサンを合成しないことが示されました。変異胞子は生存可能でしたが、溶解酵素(グルスラーゼまたはZymolyase)に敏感でした。ほとんどのDIT変異体とは異なり、DIT101は栄養細胞で特徴的な表現型を示しました。それらは正常に成長しましたが、キチンはほとんど含まれていなかったため、毒性キチン結合染料であるカルコフルオール白に耐性がありました。細胞は、calcofluor白またはプリミュリンで壁のかろうじて検出可能な染色を示しました。栄養細胞におけるキチンの量の減少と胞子にキトサンの非存在は、変異DIT101がキチンシンターゼに欠陥がある可能性があることを示唆しました。実際、遺伝子CSD2を抱えるゲノム酵母クローンは、酵母キチンシンターゼIおよびIIと有意な配列類似性を共有しています(C. E. Bulawa(1992)、Mol。Cell。Biol。12、1764-1776)は、私たちの変異体を補完し、DIT101の染色体軌跡に対応します。したがって、変異DIT101およびCSD2(そしておそらく呼び出されます; M. H. Valdivieso et al。、(1991)、J。Cell Biol。114、101-109)は対立遺伝子であることが示されました。遺伝子は染色体IIにマッピングされ、GAL1の約3 kb遠位に位置していました。このDNAクローンを使用して、約3500〜4000ヌクレオチドの転写産物が検出されました。栄養細胞と胞子形成プロセス全体で異なる時期に胞子形成細胞から分離されたRNAを比較すると、胞子形成特異的転写調節の欠如を示すDIT101転写レベルの有意な差は検出できませんでした。ただし、DIT101転写産物の量は、有糸分裂細胞周期のさまざまな段階で大幅に変化し、セプタム形成後は細胞質化前にピークに達しました。栄養細胞のキチン合成のほとんどが細胞分裂サイクルのこの段階で発生するため、DIT101によって媒介されるキチン合成は、栄養成長細胞の転写レベルで主に調節される可能性があります。
変異体スクリーニングは、胞子壁ジティロシンが不足しているSaccharomyces cerevisiaeの変異体を分離するように設計されています。電子顕微鏡で示されているように、ほとんどの変異体胞子には、胞子壁の最も外側のジティロシンが豊富な層のみが欠けていました。しかし、変異体DIT101には、胞子壁のキトサン層がさらに不足していました。化学測定により、この変異体は胞子形成中にキトサンを合成しないことが示されました。変異胞子は生存可能でしたが、溶解酵素(グルスラーゼまたはZymolyase)に敏感でした。ほとんどのDIT変異体とは異なり、DIT101は栄養細胞で特徴的な表現型を示しました。それらは正常に成長しましたが、キチンはほとんど含まれていなかったため、毒性キチン結合染料であるカルコフルオール白に耐性がありました。細胞は、calcofluor白またはプリミュリンで壁のかろうじて検出可能な染色を示しました。栄養細胞におけるキチンの量の減少と胞子にキトサンの非存在は、変異DIT101がキチンシンターゼに欠陥がある可能性があることを示唆しました。実際、遺伝子CSD2を抱えるゲノム酵母クローンは、酵母キチンシンターゼIおよびIIと有意な配列類似性を共有しています(C. E. Bulawa(1992)、Mol。Cell。Biol。12、1764-1776)は、私たちの変異体を補完し、DIT101の染色体軌跡に対応します。したがって、変異DIT101およびCSD2(そしておそらく呼び出されます; M. H. Valdivieso et al。、(1991)、J。Cell Biol。114、101-109)は対立遺伝子であることが示されました。遺伝子は染色体IIにマッピングされ、GAL1の約3 kb遠位に位置していました。このDNAクローンを使用して、約3500〜4000ヌクレオチドの転写産物が検出されました。栄養細胞と胞子形成プロセス全体で異なる時期に胞子形成細胞から分離されたRNAを比較すると、胞子形成特異的転写調節の欠如を示すDIT101転写レベルの有意な差は検出できませんでした。ただし、DIT101転写産物の量は、有糸分裂細胞周期のさまざまな段階で大幅に変化し、セプタム形成後は細胞質化前にピークに達しました。栄養細胞のキチン合成のほとんどが細胞分裂サイクルのこの段階で発生するため、DIT101によって媒介されるキチン合成は、栄養成長細胞の転写レベルで主に調節される可能性があります。
A mutant screen has been designed to isolate mutants in Saccharomyces cerevisiae deficient in spore wall dityrosine. As shown by electron microscopy, most of the mutant spores lacked only the outermost, dityrosine-rich layer of the spore wall. Mutant dit101, however, was additionally lacking the chitosan layer of the spore wall. Chemical measurements showed that this mutant does not synthesize chitosan during sporulation. The mutant spores were viable but sensitive to lytic enzymes (glusulase or zymolyase). Unlike most of the dit-mutants, dit101 did show a distinctive phenotype in vegetative cells: they grew normally but contained very little chitin and were therefore resistant to the toxic chitin-binding dye, Calcofluor White. The cells showed barely detectable staining of the walls with Calcofluor White or primulin. The decrease in the amount of chitin in vegetative cells and the absence of chitosan in spores suggested that the mutant dit101 could be defective in a chitin synthase. Indeed, a genomic yeast clone harboring the gene, CSD2, sharing significant sequence similarity with yeast chitin synthases I and II (C. E. Bulawa (1992), Mol. Cell. Biol. 12, 1764-1776), complemented our mutant and was shown to correspond to the chromosomal locus of dit101. Thus, the mutations dit101 and csd2 (and probably also call; M. H. Valdivieso et al., (1991), J. Cell Biol. 114, 101-109) were shown to be allelic. The gene was mapped to chromosome II and was located about 3 kb distal of GAL1. Using this DNA clone, a transcript of about 3500-4000 nucleotides was detected. Comparing RNA isolated from vegetative cells and from sporulating cells at different times throughout the sporulation process, no significant differences in DIT101 transcript levels could be detected indicating absence of sporulation-specific transcriptional regulation. However, the amount of DIT101 transcript changed significantly at different stages of the mitotic cell cycle, peaking after septum formation, but before cytokinesis. As most of the chitin synthesis of vegetative cells occurs at this stage of the cell division cycle, chitin synthesis mediated by DIT101 could be primarily regulated at the level of transcription in vegetatively growing cells.
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