プロトプラストと植物全体におけるウイルスRNAの局在化のための新しい手順

共発現レポータータンパク質を使用したウイルス拡散の分析により、植物のウイルスの細胞間および長距離の動きに関する重要な詳細が提供されています。ただし、ほとんどのウイルスは、大規模な非ウイルスセグメントの挿入や、非エバイザの検出に必要なオープンリーディングフレームの喪失や、非eVasiveでウイルスを検出するために必要な手順に耐えることはできません。酵母の細胞内でmRNAを局在するために使用される手法は、植物全体でウイルスRNAを検出するために変更されました。この技術は、MS2バクテリオファージ（CPMS2）のコートタンパク質の19ベースヘアピン（HP）への結合を利用しています。CPMS2、緑色蛍光タンパク質（GFP）、および核局在信号（NLS）で構成される融合タンパク質は、プロトプラストでの過渡発現時に核局在化されました。ただし、The HPを3 '翻訳していないカブしかめたウイルス（TCV-HP）とプロトプラストへのウイルスおよび融合タンパク質コンストラクトの同時トランスフェクションにより、GFPが細胞質に再配置されました。HPの挿入も融合タンパク質との相互作用も、ウイルス機能を損なうことはありませんでした。GFP-NLS-CPMS2融合タンパク質を発現するトランスジェニック植物が生成され、GFPが若い植物細胞の核で検出されました。GFP細胞質蛍光の病巣は、接種後2日でTCV-HP接種葉で検出されました。その後、GFPは、ミッドベイン近くの若い葉と、二次脈と三次静脈の近くのトリコームの基部（支持）細胞で検出されました。古い葉では、細胞質GFPは多くの葉全体で視覚化できました。この手法は、変換可能な植物（または動物）宿主を備えたウイルスの検出に適している必要があり、適切に設計された宿主RNAを局在化するのにも役立つ可能性があります。

Analysis of virus spread using co-expressed reporter proteins has provided important details on cell-to-cell and long-distance movement of viruses in plants. However, most viruses cannot tolerate insertion of large non-viral segments or loss of any open-reading frames, procedures required to detect viruses non-evasively. A technique used to localize mRNAs intracellularly in yeast has been modified for detection of viral RNAs in whole plants. The technique makes use of the binding of the coat protein of MS2 bacteriophage (CPMS2) to a 19 base hairpin (hp). A fusion protein, consisting of the CPMS2, green fluorescent protein (GFP), and a nuclear localization signal (NLS), was nuclear-localized upon transient expression in protoplasts. However, addition of the hp to the 3' untranslated region of Turnip crinkle virus (TCV-hp) and co-transfection of the virus and fusion protein construct into protoplasts resulted in the re-location of GFP to the cytoplasm. Neither the insertion of the hp nor the interaction with the fusion protein impaired any viral functions. Transgenic plants expressing the GFP-NLS-CPMS2 fusion protein were generated, and GFP was detected in nuclei of young plant cells. Foci of GFP cytoplasmic fluorescence were detected in TCV-hp-inoculated leaves at 2 days post-inoculation. Later, GFP was detected in young leaves near the midvein and in the base (support) cells of trichomes in the vicinity of secondary and tertiary veins. In older leaves, cytoplasmic GFP could be visualized throughout many of the leaves. This technique should be amenable for detection of any virus with a transformable plant (or animal) host and may also prove useful for localizing properly engineered host RNAs.