トランススプライシングリボザイムによる鎌状-グロビンRNAの効率的かつ特異的修復

以前は、in vitro転写されたリボザイムの哺乳類細胞へのトランスフェクション時に鎌状赤血球グロビン転写産物を修復するためにトランススプライシングを実行できることを実証しました。ここでは、遺伝子移動後に高レベルの活性リボザイムを生成する発現カセットを開発しようとしました。私たちの最初の発現構築物は、6ヌクレオチドの長い内部ガイドシーケンスを含むリボザイムを使用した以前のRNAトランスフェクション研究で使用されたリボザイムと同一のトランススライスリボザイムを生成するように設計されました。しかし、これらのカセットから発現したリボザイムは、鎌状赤血球グロビンRNAを修復できないことがわかりました。さらなる実験により、リボザイム媒介RNA修復には2つの追加の構造要素が重要であることが明らかになりました。リボザイムの5 '末端と3'エクソンの始まりと、拡張ガイドシーケンスの間に形成される追加の塩基対相互作用の間に形成されたP10相互作用が明らかになりました。および基質RNA。これらの最適化された発現カセットは、トランスフェクトされた哺乳類細胞における鎌状節ベータグロビンRNAの10％〜50％を修正できるリボザイムを生成します。最後に、5-bp拡張ガイド配列を備えたリボザイムは、野生型ベータグロビンRNAよりも鎌状赤ベータグロビンRNAと優先的に反応しますが、野生型ベータグロビン転写産物はリボジンと単一の不一致のみを形成します。これらの結果は、トランススプライシングリボザイム発現カセットを生成して、哺乳類細胞における症状のある鎌状-globin RNAの臨床的に関連する割合を修復できるリボザイムを生成できることを示しています。

Previously we demonstrated that a group I ribozyme can perform trans-splicing to repair sickle beta-globin transcripts upon transfection of in vitro transcribed ribozyme into mammalian cells. Here, we sought to develop expression cassettes that would yield high levels of active ribozyme after gene transfer. Our initial expression constructs were designed to generate trans-slicing ribozymes identical to those used in our previous RNA transfection studies with ribozymes containing 6-nucleotide long internal guide sequences. The ribozymes expressed from these cassettes, however, were found to be unable to repair sickle beta-globin RNAs. Further experiments revealed that two additional structural elements are important for ribozyme-mediate RNA repair: the P10 interaction formed between the 5' end of the ribozyme and the beginning of the 3' exon and an additional base-pairing interaction formed between an extended guide sequence and the substrate RNA. These optimized expression cassettes yield ribozymes that are able to amend 10%-50% of the sickle beta-globin RNAs in transfected mammalian cells. Finally, a ribozyme with a 5-bp extended guide sequence preferentially reacts with sickle beta-globin RNAs over wild-type beta-globin RNAs, although the wild-type beta-globin transcript forms only a single mismatch with the ribozyme. These results demonstrate that trans-splicing ribozyme expression cassettes can be generated to yield ribozymes that can repair a clinically relevant fraction of sickle beta-globin RNAs in mammalian cells with greatly improved specificity.