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ワクシニアウイルスmRNAキャッピング酵素の大小のサブユニットを発現できるプラスミドベクターを構築し、大腸菌を変換するために使用しました。二量体酵素または可溶性形態の個々のサブユニットの誘導の条件が特定され、キャッピング酵素は均一性に近づいて精製されました。細菌中のキャッピング酵素のタンパク質分解により、mRNAトリホスファターゼおよびグアニルトランスフェラーゼ活性を持つことが以前に示された60 kDA産物が得られます（Shuman、S。（1990）J。Biol。Chem。265、11960-11966）は分離され、アミノ酸によって示されました。D1RのNH2末端から導出される配列分析。個々のサブユニットは、単独でアッセイしたときにメチルトランスフェラーゼ活性を欠いていました。ただし、D1RとD12Lサブユニットを混合すると、メチルトランスフェラーゼ活性の再構成が可能になり、この活動におけるこの外観はサブユニットの関連に伴いました。対照的に、D12LサブユニットとD1R-60Kタンパク質分解断片を混合すると、メチルトランスフェラーゼ活性が得られたり、2つのタンパク質の物理的な関連性が生じたりすることができませんでした。これらの結果は、メチルトランスフェラーゼ活性部位がD1Rサブユニットのカルボキシル末端部分を持つD12Lサブユニットの存在を必要とすることを示しています。さらに、mRNAトリホスファターゼとグアニルトランスフェラーゼ活性部位はD1RサブユニットのNH2末端ドメインに存在するため、メチルトランスフェラーゼ活性はこのサブユニットとD12Lのカルボン末端部分に見られます。この酵素。
ワクシニアウイルスmRNAキャッピング酵素の大小のサブユニットを発現できるプラスミドベクターを構築し、大腸菌を変換するために使用しました。二量体酵素または可溶性形態の個々のサブユニットの誘導の条件が特定され、キャッピング酵素は均一性に近づいて精製されました。細菌中のキャッピング酵素のタンパク質分解により、mRNAトリホスファターゼおよびグアニルトランスフェラーゼ活性を持つことが以前に示された60 kDA産物が得られます（Shuman、S。（1990）J。Biol。Chem。265、11960-11966）は分離され、アミノ酸によって示されました。D1RのNH2末端から導出される配列分析。個々のサブユニットは、単独でアッセイしたときにメチルトランスフェラーゼ活性を欠いていました。ただし、D1RとD12Lサブユニットを混合すると、メチルトランスフェラーゼ活性の再構成が可能になり、この活動におけるこの外観はサブユニットの関連に伴いました。対照的に、D12LサブユニットとD1R-60Kタンパク質分解断片を混合すると、メチルトランスフェラーゼ活性が得られたり、2つのタンパク質の物理的な関連性が生じたりすることができませんでした。これらの結果は、メチルトランスフェラーゼ活性部位がD1Rサブユニットのカルボキシル末端部分を持つD12Lサブユニットの存在を必要とすることを示しています。さらに、mRNAトリホスファターゼとグアニルトランスフェラーゼ活性部位はD1RサブユニットのNH2末端ドメインに存在するため、メチルトランスフェラーゼ活性はこのサブユニットとD12Lのカルボン末端部分に見られます。この酵素。
Plasmid vectors capable of expressing the large and small subunits of the vaccinia virus mRNA capping enzyme were constructed and used to transform Escherichia coli. Conditions for the induction of the dimeric enzyme or the individual subunits in a soluble form were identified, and the capping enzyme was purified to near homogeneity. Proteolysis of the capping enzyme in bacteria yields a 60-kDa product shown previously to possess the mRNA triphosphatase and guanyltransferase activities (Shuman, S. (1990) J. Biol. Chem. 265, 11960-11966) was isolated and shown by amino acid sequence analysis to be derived from the NH2 terminus of D1R. The individual subunits lacked methyltransferase activity when assayed alone. However, mixing the D1R and D12L subunits permitted reconstitution of the methyltransferase activity, and this appearance in activity accompanied the association of the subunits. In contrast, mixing the D12L subunit with the D1R-60K proteolytic fragment failed to yield methyltransferase activity or result in a physical association of the two proteins. These results demonstrate that the methyltransferase active site requires the presence of the D12L subunit with the carboxyl-terminal portion of the D1R subunit. Furthermore, since the mRNA triphosphatase and guanyltransferase active sites reside in the NH2-terminal domain of the D1R subunit, and the methyltransferase activity is found in the carboxyl-terminal portion of this subunit and D12L, there must be at least two separate active sites in this enzyme.
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