フローサイトメトリーによって測定されたアポトーシス細胞の特徴

現在のレビューでは、細胞死、アポトーシス、壊死の2つの異なるメカニズムを特徴付け、区別するいくつかの方法について説明しています。これらの方法のほとんどは、DNAトポイソメラーゼIまたはII阻害剤によるヒト白血病HL-60細胞株、およびトポイソメラーゼ阻害剤またはプレドニゾロンのいずれかによるラット胸腺細胞でトリガーされたアポトーシスの研究に適用されました。ほとんどの場合、アポトーシスは細胞周期の特定の段階で細胞に選択的でした。S相HL-60細胞とG0胸腺細胞のみが主に影響を受けました。壊死は、これらの薬物の過度に高濃度によって誘発されました。次の細胞特徴は、細胞死のモードを特徴付けるのに有用であることが判明しました。a）アポトーシック細胞におけるエンドヌクレアーゼの活性化は、細胞透過後の低分子量DNAの抽出をもたらし、DNAによる染色性の低下をもたらしました。特定のフルオロクロム。DNA含有量の測定により、アポトーシス細胞を特定し、アポトーシスプロセスの細胞周期相の相特異性を認識することが可能になりました。b）壊死性細胞ではなく壊死で失われる原形質膜の完全性は、ヨウ化プロピジウム（PI）の除外によって調査されました。Hoechst 33342が続くPiの組み合わせは、ライブ、壊死、初期、および後期アポトーシス細胞を区別するための優れたプローブであることが証明されました。c）ローダミン123の保持によってアッセイされたミトコンドリア膜貫通電位は、壊死細胞ではなくアポトーシスに保存されていました。d）アクリジンオレンジ（AO）の超発性摂取によってテストされたATP依存性リソソームプロトンポンプもアポトーシスでは保存されていませんが、壊死細胞ではありませんでした。e）DNAおよびタンパク質のために染色された細胞の二変量解析により、おそらく内因性プロテアーゼの活性化が原因で、アポトーシス細胞のタンパク質含有量が著しく減少したことが明らかになりました。漏れやすい膜を有する壊死細胞は、タンパク質含有量が最小限でした。f）G1細胞からのG0の識別を可能にしたため、アポトーシスがG0胸腺細胞に選択的であることを明らかにすることが可能になりました。G）前方光散乱の減少は、アポトーシス中の初期の変化であった変化なし（HL-60細胞）または直角散乱の増加（胸腺細胞）のいずれかによって平行しました。H）変性に対するその場でのDNAの感度は、アポトーシス細胞および壊死細胞で増加しました。この特徴は、低pHでAOで染色することで調査され、ライブ、アポトーシス、壊死細胞を区別し、これらのプロセスの細胞周期相の特異性を評価するための高感度かつ早期のアッセイを提供しました。i）標識されたトリホスフォヌクレオチドを使用したin situニック翻訳アッセイを使用して、DNA鎖切断を明らかにし、アポトーシスの非常に初期段階を検出できます（400語で切り捨てられた要約）

The present review describes several methods to characterize and differentiate between two different mechanisms of cell death, apoptosis and necrosis. Most of these methods were applied to studies of apoptosis triggered in the human leukemic HL-60 cell line by DNA topoisomerase I or II inhibitors, and in rat thymocytes by either topoisomerase inhibitors or prednisolone. In most cases, apoptosis was selective to cells in a particular phase of the cell cycle: only S-phase HL-60 cells and G0 thymocytes were mainly affected. Necrosis was induced by excessively high concentrations of these drugs. The following cell features were found useful to characterize the mode of cell death: a) Activation of an endonuclease in apoptocic cells resulted in extraction of the low molecular weight DNA following cell permeabilization, which, in turn, led to their decreased stainability with DNA-specific fluorochromes. Measurements of DNA content made it possible to identify apoptotic cells and to recognize the cell cycle phase specificity of the apoptotic process. b) Plasma membrane integrity, which is lost in necrotic but not apoptotic cells, was probed by the exclusion of propidium iodide (PI). The combination of PI followed by Hoechst 33342 proved to be an excellent probe to distinguish live, necrotic, early- and late-apoptotic cells. c) Mitochondrial transmembrane potential, assayed by retention of rhodamine 123 was preserved in apoptotic but not necrotic cells. d) The ATP-dependent lysosomal proton pump, tested by the supravital uptake of acridine orange (AO) was also preserved in apoptotic but not necrotic cells. e) Bivariate analysis of cells stained for DNA and protein revealed markedly diminished protein content in apoptotic cells, most likely due to activation of endogenous proteases. Necrotic cells, having leaky membranes, had minimal protein content. f) Staining of RNA allowed for the discrimination of G0 from G1 cells and thus made it possible to reveal that apoptosis was selective to G0 thymocytes. g) The decrease in forward light scatter, paralleled either by no change (HL-60 cells) or an increase (thymocytes) of right angle scatter, were early changes during apoptosis. h) The sensitivity of DNA in situ to denaturation, was increased in apoptotic and necrotic cells. This feature, probed by staining with AO at low pH, provided a sensitive and early assay to discriminate between live, apoptotic and necrotic cells, and to evaluate the cell cycle phase specificity of these processes. i) The in situ nick translation assay employing labeled triphosphonucleotides can be used to reveal DNA strand breaks, to detect the very early stages of apoptosis.(ABSTRACT TRUNCATED AT 400 WORDS)