ヒトシクロフィリンの活性部位変異体シクロスポリンからの別のペプチジルプロリルイソメラーゼ活性結合およびカルシニューリン阻害

最近のX線構造情報に基づいて、推定活性部位の残基（H54、F60、Q111、F113、およびH126）の残基を含むヒトシクロフィリンA（HCYPA）の6つの部位指向変異体が構築され、過剰発現、過剰発現、大腸菌から均一性に精製されました。タンパク質W121A（Liu、J.、Chen、C.-M。、＆Walsh、C.T.、1991a、Biochemistry 30、2306-2310）、H54Q、R55A、F60A、Q111A、F113A、およびH126Qは、CIS-Transansedについてアセルスされました。CSAの存在下での免疫抑制薬シクロスポリンA（CSA）およびタンパク質ホスファターゼ2B（カルシニューリン）阻害を結合する能力、ペプチジル - プロリルイソメラーゼ（PPIASE）活性。結果は、H54Q、Q111A、F113A、およびW121Aが野生型組換えHCYPAの触媒効率（KCAT/km）の3-15％を保持していることを示しています。残りの3つの変異体（R55A、F60A、およびH126Q）はそれぞれ、野生型触媒効率の1％未満を保持しており、PPIase触媒にこれらの残基による関与を示しています。CSAアフィニティマトリックスに結合した各変異体。変異体R55A、F60A、F113A、およびH126QはCSAの存在下でカルシヌーリンを阻害しましたが、W121Aはそうではありませんでした。CSAはPPIase活性の競合阻害剤ですが、酵素的に不活性なシクロフィリンと複合し、カルシニューリンのホスファターゼ活性を阻害する可能性があります。

Based on recent X-ray structural information, six site-directed mutants of human cyclophilin A (hCyPA) involving residues in the putative active site--H54, R55, F60, Q111, F113, and H126--have been constructed, overexpressed, and purified from Escherichia coli to homogeneity. The proteins W121A (Liu, J., Chen, C.-M., & Walsh, C.T., 1991a, Biochemistry 30, 2306-2310), H54Q, R55A, F60A, Q111A, F113A, and H126Q were assayed for cis-trans peptidyl-prolyl isomerase (PPIase) activity, their ability to bind the immunosuppressive drug cyclosporin A (CsA), and protein phosphatase 2B (calcineurin) inhibition in the presence of CsA. Results indicate that H54Q, Q111A, F113A, and W121A retain 3-15% of the catalytic efficiency (kcat/Km) of wild-type recombinant hCyPA. The remaining three mutants (R55A, F60A, and H126Q) each retain less than 1% of the wild-type catalytic efficiency, indicating participation by these residues in PPIase catalysis. Each of the mutants bound to a CsA affinity matrix. The mutants R55A, F60A, F113A, and H126Q inhibited calcineurin in the presence of CsA, whereas W121A did not. Although CsA is a competitive inhibitor of PPIase activity, it can complex with enzymatically inactive cyclophilins and inhibit the phosphatase activity of calcineurin.