Semliki Forest Virus Repliconに基づく動物細胞発現ベクターの新世代

Semliki Forest Wirus（SFV）Repliconに基づいた新しいDNA発現システムを開発しました。これは、動物細胞宿主の幅広い選択、高効率、使いやすさを組み合わせています。関心のあるDNAは、組換えRNAのin vitro合成のテンプレートとして機能するSFVプラスミドベクターにクローニングされます。RNAは、エレクトロポレーションにより、動物組織培養細胞への実質的に100％の効率でトランスフェクトされます。細胞内では、組換えRNAが独自の複製とキャッピングを駆動し、宿主タンパク質合成を競合しながら、異種タンパク質の大規模な産生につながります。発現システムには、包装欠損ヘルパーRNA分子を使用して共輸送を使用して、組換えRNAが感染性ウイルス粒子にパッケージ化されるin vivoパッケージング手順も含まれています。得られた高力価組換えウイルスストックを使用して、異種遺伝子産物のその後の高い発現で広範囲の動物細胞に感染するが、ヘルパーの構造タンパク質の発現はありません。感染した細胞は、感染後最大75時間のタンパク質を産生し、その後、異種生成物は総細胞タンパク質の25％を構成することができます。システムの一般的な有用性は、ヒトトランスフェリン受容体、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ、チックリゾチーム、および大腸菌ベータガラクトシダーゼの発現を通じて実証されています。

We have developed a novel DNA expression system, based on the Semliki Forest virus (SFV) replicon, which combines a wide choice of animal cell hosts, high efficiency and ease of use. DNA of interest is cloned into SFV plasmid vectors that serve as templates for in vitro synthesis of recombinant RNA. The RNA is transfected with virtually 100% efficiency into animal tissue culture cells by means of electroporation. Within the cell, the recombinant RNA drives its own replication and capping and leads to massive production of the heterologous protein while competing out the host protein synthesis. The expression system also includes an in vivo packaging procedure whereby recombinant RNA is packaged into infectious virus particles using cotransfection with packaging-deficient helper RNA molecules. The resulting high titer recombinant virus stock can be used to infect a wide range of animal cells with subsequent high expression of the heterologous gene product, but without expression of any structural proteins of the helper. The infected cells produce protein for up to 75 hours post infection after which the heterologous product can constitute as much as 25% of the total cell protein. The general utility of the system is demonstrated through the expression of human transferrin receptor, mouse dihydrofolate reductase, chick lysozyme and Escherichia coli beta-galactosidase.