3つの一意のCa（2+） - ヒトアネキシンIIの結合部位のマッピング

部位指向の突然変異誘発を使用して、Ca（2+）IIのCa（2+） - 結合部位、Ca（2+）のアネキシンファミリーのメンバーであり、チロシンの主要な細胞基質として機能するリン脂質結合タンパク質の結合部位を採用しました。SRC癌遺伝子によってコードされたキナーゼ。いくつかの単一のアミノ酸置換がヒトアネキシンIIに導入され、さまざまなアッセイでCa2+に対する親和性のためにさまざまな変異タンパク質が採点されました。データは、以前の発見をサポートしています[Thiel、C.、Weber、K。and Gerke V.（1991）J。Biol。化学。266、14,732-14,739] Ca（2+） - 結合部位は、アネキシンIIの33 kDaタンパク質コアを含む4つの繰り返しセグメントの3分の1に存在すること。3回目の繰り返しの高度に保存されたエンドネキシンfoldに局在するGly206およびThr207に加えて、Glu246はこのサイトの形成に関与しています。したがって、このCa（2+） - 溶液中の結合部位のアーキテクチャは、アネキシンv結晶で最近特定されたCa2+部位のアーキテクチャと同一ではないにしても、非常に類似しています[Huber、R.、Schneider、M.、Mayr、I。、Römisch、J。およびPaques、E.-P。（1990）Febs Lett。275、15-21]。リピート3のサイトに加えて、アネキシンIIのリピート2および4には、おそらく同様のアーキテクチャのサイトをマッピングしました。繰り返しになりますが、エンドネキシン折りの位置4の保存グリシンからC末端40残基に位置する酸性アミノ酸は、高親和性Ca2+結合には不可欠です：2番目の繰り返しのASP161、ASP321。対照的に、繰り返し1には、対応する位置に酸性アミノ酸が含まれておらず、保存されたグリシンを囲むシーケンスの他の反復からの逸脱も示しています。アネキシンIIでのこれらの結果は、アネキシンVの結晶学的情報とともに、アネキシンがCa2+部位の位置で異なる可能性があることを明らかにしています。CA（2+） - 同様の構造の結合部位は、アネキシンIIの反復2、3、および4に存在しますが、アネキシンVでは反復1、2、および4で発生します。3つのCa2+サイト。この分子は、二重陽イオンに対する親和性が大幅に減少したことを示しています。ただし、Ca2+にバインドすることができ、おそらく異なるアーキテクチャの追加のCa2+サイトの存在を示しています。

Site-directed mutagenesis was employed to map and characterize Ca(2+)-binding sites in annexin II, a member of the annexin family of Ca(2+)- and phospholipid-binding proteins which serves as a major cellular substrate for the tyrosine kinase encoded by the src oncogene. Several single amino acid substitutions were introduced in the human annexin II and the various mutant proteins were scored for their affinity towards Ca2+ in different assays. The data support our previous finding [Thiel, C., Weber, K. and Gerke V. (1991) J. Biol. Chem. 266, 14,732-14,739] that a Ca(2+)-binding site is present in the third of the four repeat segments which comprise the 33-kDa protein core of annexin II. In addition to Gly206 and Thr207, which are localized in the highly conserved endonexin fold of the third repeat, Glu246 is involved in the formation of this site. Thus the architecture of this Ca(2+)-binding site in solution is very similar, if not identical, to that of Ca2+ sites identified recently in annexin V crystals [Huber, R., Schneider, M., Mayr, I., Römisch, J. and Paques, E.-P. (1990) FEBS Lett. 275, 15-21]. In addition to the site in repeat 3, we have mapped sites of presumably similar architecture in repeats 2 and 4 of annexin II. Again, an acidic amino acid which is located 40 residues C-terminal to the conserved glycine at position 4 of the endonexin fold is indispensable for high-affinity Ca2+ binding: Asp161 in the second and Asp321 in the fourth repeat. In contrast, repeat 1 does not contain an acidic amino acid at a corresponding position and also shows deviations from the other repeats in the sequence surrounding the conserved glycine. These results on annexin II together with the crystallographic information on annexin V reveal that annexins can differ in the position of the Ca2+ sites. Ca(2+)-binding sites of similar structure are present in repeats 2, 3, and 4 of annexin II while in annexin V they occur in repeats 1, 2, and 4. We also synthesized an annexin II derivative with mutations in all three Ca2+ sites. This molecule shows a greatly reduced affinity for the divalent cation. However, it is still able to bind Ca2+, indicating the presence of (an) additional Ca2+ site(s) of presumably different architecture.