コロナウイルスリボソームフレームシフトシグナルの「滑りやすいシーケンス」成分の変異解析

コロナウイルスIBVのゲノムRNAのリボソームフレームシフト信号は、ヘプタヌクレオチドの「滑りやすいシーケンス」と下流のRNA pseudoknotという2つの元素で構成されています。一連の滑りやすいシーケンス変異体のフレームシフト特性を分析することにより、IBVフレームシフトサイトで機能できる種類の滑りやすいシーケンスを調査しました。最初に、IBVのフレームシフトの部位がヘプタヌクレオチドストレッチUUUAAACにあることを確認し、次に擬似ヌット構造と適切なレポーター遺伝子の知識を使用して、リボソームフレームシフトの大きさと方向の両方を決定で​​きる発現構造の両方を調製することを使用しました。候補の滑りやすいシーケンス。私たちの結果は、テストされたほぼすべてのシーケンスで、フレームシフトが厳密に-1読み取りフレームにあることを示しています。ただし、ヌクレオチドの単調な走行は、検出可能なレベルの-2/+1フレームシフト製品を提供し、特にUTRETISは有意なレベル（2％〜21％）を与えました。予備的な証拠は、RNA pseudoknotがフレームシフトの方向に影響を与える上で役割を果たす可能性があることを示唆しています。この分析でテストされたスリップシーケンスのスペクトルには、in vivoで利用されると既知または疑われるすべてのものが含まれていました。我々の結果は、Cトリプレットは最も効果的ではなかったが、滑り（xxxyyyn）に続いてリボソームP部品でデコードされた場合、A、C、G、およびUのトリプレットは機能的であることを示しています。Aサイト（xxyyyyn）では、CとGのトリプレットは機能していませんでした。滑りやすいシーケンス（xxxyyyn）の位置7のヌクレオチドの同一性は、フレームシフト効率の重要な決定要因であることがわかっており、Aサイトコドンの階層がフレームシフトの階層が存在することを示しています。これらの観察結果は、特定の部位でのリボソームフレームシフトが、少なくとも部分的には、正常な細胞TRNAとAサイトコドンとの相互作用の強度によって決定されることを示唆し、必ずしも特殊な「シフティ」TRNAを含むとは限りません。

The ribosomal frameshift signal in the genomic RNA of the coronavirus IBV is composed of two elements, a heptanucleotide "slippery-sequence" and a downstream RNA pseudoknot. We have investigated the kinds of slippery sequence that can function at the IBV frameshift site by analysing the frameshifting properties of a series of slippery-sequence mutants. We firstly confirmed that the site of frameshifting in IBV was at the heptanucleotide stretch UUUAAAC, and then used our knowledge of the pseudoknot structure and a suitable reporter gene to prepare an expression construct that allowed both the magnitude and direction of ribosomal frameshifting to be determined for candidate slippery sequences. Our results show that in almost all of the sequences tested, frameshifting is strictly into the -1 reading frame. Monotonous runs of nucleotides, however, gave detectable levels of a -2/+1 frameshift product, and U stretches in particular gave significant levels (2% to 21%). Preliminary evidence suggests that the RNA pseudoknot may play a role in influencing frameshift direction. The spectrum of slip-sequences tested in this analysis included all those known or suspected to be utilized in vivo. Our results indicate that triplets of A, C, G and U are functional when decoded in the ribosomal P-site following slippage (XXXYYYN) although C triplets were the least effective. In the A-site (XXYYYYN), triplets of C and G were non-functional. The identity of the nucleotide at position 7 of the slippery sequence (XXXYYYN) was found to be a critical determinant of frameshift efficiency and we show that a hierarchy of frameshifting exists for A-site codons. These observations lead us to suggest that ribosomal frameshifting at a particular site is determined, at least in part, by the strength of the interaction of normal cellular tRNAs with the A-site codon and does not necessarily involve specialized "shifty" tRNAs.