Saccharomyces cerevisiae Myristoyl-coenzyme A：タンパク質N-ミリストイルトランスフェラーゼ変異体およびヒト/酵母nmtキメラの大腸菌およびs cerevisiaeの触媒活性と基質特異性の研究

Saccharomyces cerevisiae myristoyl-coa：タンパク質N-ミリストイルトランスフェラーゼ（NMT1P）は、455-レシド、モノマー酵素です。NMT1Pのアミノおよびカルボキシル末端欠失変異体は、触媒活性を維持するために必要な最小ドメインを決定するために遺伝的に操作されました。酵素活性は、（I）NMT1Pまたはその変異誘導体を連続的に誘導し、野生型酵素の2つの真核生物基質の1つ（S. cerevisiae GPA1PおよびラットGOアルファ）によって評価されました。外因性[3H]ミリステートのGタンパク質アルファサブユニットへのNMT依存性組み込み、または（ii）野生型または変異体NMTを産生する細菌から調製された溶解物を使用したin vitro酵素アッセイ。データは、NMT1Pの最小触媒ドメインがILE59-> PHE96とGLY451-> LEU455の間に位置することを示しています。変異体NMTPが、細胞脂肪酸シンテターゼの遮断の有無にかかわらず、豊富な培地で成長した酵母の半数体株におけるNMT1ヌル対立遺伝子の致死表現型を救助する能力の分析は、NMT1Pのアミノ末端59残基が再生される可能性があることを示唆しています。ターゲティング信号として機能する重要な非触媒的役割により、このサイトゾル酵素は、アシルCoAシンテターゼ（S）による外因性C14：0の活性化から生成された細胞のミリストイルCoAプールにアクセスできます。さらに、脂肪酸シンテターゼとアシルCoAシンテターゼに由来するミリストイルCoAプールの位置またはアクセシビリティに違いがあるようです。大腸菌の共発現システムを使用して、NMT1PおよびオーソロガスヒトNMTのペプチド基質特異性の違いを決定する構造要素をマッピングしました。ラットゴーアルファは両方の酵素の基質ですが、ヒトGZアルファはヒトNMTのみの基質です。アミノまたは酵母NMTのアミノまたはカルボキシル末端部分の元素で構成される一連のキメラ酵素の研究は、（i）GZアルファの認識/利用が、Leu352によって定義された領域を通じてアミノ末端半分から分布した要素を含むことを示しています。 - > 416残基のヒト酵素のLys410および（II）これらの酵素のいずれかにおける完全に機能的なペプチド結合部位の形成と完全に機能的なミリストイルCoA結合部位の形成には、アミノ末端とカルボキシル末端の両方の両方からの寄与が必要です。

Saccharomyces cerevisiae myristoyl-CoA:protein N-myristoyltransferase (Nmt1p) is an essential, 455-residue, monomeric enzyme. Amino- and carboxyl-terminal deletion mutants of Nmt1p were genetically engineered to determine the minimal domain necessary to maintain catalytic activity. Enzyme activity was assessed by (i) sequentially inducing Nmt1p or its mutant derivatives and one of two eukaryotic substrates for the wild type enzyme (S. cerevisiae Gpa1p and rat Go alpha) in Escherichia coli, a bacterium with no endogenous myristoyltransferase activity, and monitoring Nmt-dependent incorporation of exogenous [3H]myristate into the G protein alpha subunits or (ii) an in vitro enzyme assay using lysates prepared from bacteria producing wild type or mutant Nmts. The data indicate that the minimal catalytic domain of Nmt1p is located between Ile59-->Phe96 and Gly451-->Leu455. Analyses of the ability of mutant nmtps to rescue the lethal phenotype of an nmt1 null allele in a haploid strain of yeast grown on rich media, with or without blockade of cellular fatty acid synthetase, suggest that the amino-terminal 59 residues of Nmt1p may play an important noncatalytic role, functioning as a targeting signal so this cytosolic enzyme can access cellular myristoyl-CoA pools generated from activation of exogenous C14:0 by acyl-CoA synthetase(s). Moreover, there appear to be differences in the location or accessibility of myristoyl-CoA pools derived from fatty acid synthetase and acyl-CoA synthetases. The E. coli co-expression system was used to map structural elements that determine differences in the peptide substrate specificities of Nmt1p and the orthologous human Nmt. Rat Go alpha is a substrate for both enzymes, whereas human Gz alpha is a substrate only for human NMT. Studies of a series of chimeric enzymes composed of elements from the amino- or carboxyl-terminal portions of human and yeast Nmts indicate that (i) recognition/utilization of Gz alpha involves elements distributed from the amino-terminal half through the region defined by Leu352-->Lys410 of the 416 residue human enzyme and (ii) formation of a fully functional peptide binding site and a fully functional myristoyl-CoA binding site in either of these enzymes requires contributions from both their amino-terminal and carboxyl-terminal halves.