ヘリコバクターピロリフラジェリン遺伝子のクローニングと遺伝的特性

Helicobacter Pyloriは、極地鞘の鞭毛を生成します。これは、ヒト胃粘膜の細菌コロニー形成に不可欠であると考えられています。ここでは、鞭毛フィラメントのサブユニットである鞭毛をコードするH. pylori遺伝子のクローニングと遺伝的特性について報告します。精製されたフラジェリンのN末端アミノ酸配列に由来するオリゴヌクレオチドプローブを使用したピロリH.ピロリのゲノムライブラリーのスクリーニングは、9.3 kb BG/IIフラグメントにフラジェリンをエンコードする遺伝子FLAAを運ぶ組換えプラスミドクローンを引き起こしました。FLAAのヌクレオチド配列は、1530ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを明らかにし、53.2 kDaの予測分子量を持つタンパク質をコードしました。H. pylori flagellin（FLAA）と他の細菌性鞭毛のシーケンスアライメントは、密接に関連するカンピロバクターのものを含む、アミノ末端およびカルボキシ末端領域の高度な類似性を示しています（Campylobacter coli flaaとの56％のアイデンティティ）、しかし、中央のドメインにはほとんど相同性がありません。FLAA特異的プローブによる染色体DNAの南部ハイブリダイゼーションでは、ピロリH.に追加の相同鞭毛遺伝子の存在が明らかになりませんでした。FLAA隣接領域の配列分析とプライマー拡張実験によるFLAA mRNAスタート部位のマッピングは、遺伝子の転写がH. pyloriのSigma 28特異的プロモーター配列の制御下にあることを示しました。FLAAプロモーターの上流の領域は、局所DNA修飾の対象となり、株898-1の染色体における3つの密接にリンクされたヒンディーイ制限部位のうち2つのマスキングが得られます。組換えプラスミドを抱える大腸菌株は、大腸菌プラスミド発現系を使用してFLAA融合タンパク質で得られた全長の鞭毛を産生しませんでした。

Helicobacter pylori produces polar sheathed flagella, which are believed to be essential for the bacterial colonization of the human gastric mucosa. Here we report on the cloning and genetic characterization of a H. pylori gene encoding the subunit of the flagellar filament, the flagellin. Screening of a genomic library of H. pylori with an oligonucleotide probe derived from the N-terminal amino acid sequence of purified flagellin resulted in a recombinant plasmid clone carrying the flagellin-encoding gene flaA on a 9.3 kb Bg/II fragment. The nucleotide sequence of flaA revealed an open reading frame of 1530 nucleotides, encoding a protein with a predicted molecular mass of 53.2 kDa, which is similar in size with the purified flagellin protein in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Sequence alignment of H. pylori flagellin (FlaA) with other bacterial flagellins demonstrates a high degree of similarity in the amino-terminal and carboxy-terminal regions, including those of the closely related genus Campylobacter (56% overall identity with Campylobacter coli flaA), but little homology in the central domain. Southern hybridizations of chromosomal DNA with flaA-specific probes did not reveal the presence of additional homologous flagellin genes in H. pylori. Sequence analysis of the flaA flanking regions and mapping of the flaA mRNA start site by a primer extension experiment indicated that transcription of the gene is under the control of a sigma 28-specific promoter sequence in H. pylori. The region upstream of the flaA promoter is subject to local DNA modification, resulting in the masking of two out of three closely linked HindIII restriction sites in the chromosome of strain 898-1. Escherichia coli strains harbouring the recombinant plasmid did not produce full-length flagellin and data obtained with FlaA fusion proteins using an E. coli plasmid expression system suggest that a distinct nucleotide sequence in the gene interferes with productive translation of this protein in E. coli.