異種外膜とペリプラズムタンパク質の大腸菌外膜小胞への取り込み

グラム陰性細菌は、外膜とペリプラズム成分で構成される外膜小胞を流します。病原性細菌の小胞には毒性因子が含まれており、真核細胞と相互作用することが示されているため、小胞は送達車両として振る舞うことが提案されています。私たちは、異種発現タンパク質が小胞の膜と内腔に組み込まれるかどうか、およびこれらの変化した小胞が宿主細胞と関連するかどうかを判断したかった。腸内膜からの外膜アドヘシン/インビシンであるAILは、精製された外膜で、大腸菌株DH5アルファ株、HB101、およびMC4100の小胞で検出されました。小胞ホスト細胞の共インキュベーションアッセイでは、AILを含む小胞がAILのない小胞とは異なり、真核細胞によって内在化されることがわかりました。内腔の小胞含有量を修正して宿主細胞に送達できるかどうかを判断するために、末端に発現した緑色蛍光タンパク質（GFP）を使用しました。TATシグナル配列と融合したGFPは、実験室の大腸菌株DH5アルファと病原性エンテキシ酸化酸素誘発性大腸菌株43886の両方で、ツインアルギニン輸送体（TAT）を介してペリプラズムに分泌されました。-GFP変換株は、GFPが無傷の小胞の中にあることを示しています。GFP貨物を含めると、小胞密度が増加しましたが、小胞の形態学的変化をもたらしませんでした。これらの研究は、異種発現した外膜とペリプラズムタンパク質の細菌小胞への取り込みを実証する最初の研究です。

Gram-negative bacteria shed outer membrane vesicles composed of outer membrane and periplasmic components. Since vesicles from pathogenic bacteria contain virulence factors and have been shown to interact with eukaryotic cells, it has been proposed that vesicles behave as delivery vehicles. We wanted to determine whether heterologously expressed proteins would be incorporated into the membrane and lumen of vesicles and whether these altered vesicles would associate with host cells. Ail, an outer membrane adhesin/invasin from Yersinia enterocolitica, was detected in purified outer membrane and in vesicles from Escherichia coli strains DH5alpha, HB101, and MC4100 transformed with plasmid-encoded Ail. In vesicle-host cell co-incubation assays we found that vesicles containing Ail were internalized by eukaryotic cells, unlike vesicles without Ail. To determine whether lumenal vesicle contents could be modified and delivered to host cells, we used periplasmically expressed green fluorescent protein (GFP). GFP fused with the Tat signal sequence was secreted into the periplasm via the twin arginine transporter (Tat) in both the laboratory E. coli strain DH5alpha and the pathogenic enterotoxigenic E. coli ATCC strain 43886. Pronase-resistant fluorescence was detectable in vesicles from Tat-GFP-transformed strains, demonstrating that GFP was inside intact vesicles. Inclusion of GFP cargo increased vesicle density but did not result in morphological changes in vesicles. These studies are the first to demonstrate the incorporation of heterologously expressed outer membrane and periplasmic proteins into bacterial vesicles.