RAC1によるRho特異的グアニンヌクレオチド交換因子DBSのPleckstrin相同性ドメインを介した活性化

DBSは、NIH 3T3マウス線維芽細胞の規制緩和を引き起こす発現を引き起こすタンパク質のスクリーニングで特定されたRho特異的なグアニンヌクレオチド交換因子です。Rac1は、in vitroまたはin vivoアッセイのいずれかのDBSの基質であることが示されていませんが、DBSのラットオルソログ（OST）は、in vitroでGTP.RAC1に特異的に結合することが示されています。RAC1/DBS相互作用のGTPに対する依存性は、DBSが実際にRAC1のエフェクターである可能性があることを示唆しています。ここでは、活性化されたRAC1とDBSの間の相互作用が哺乳類細胞で再現できること、およびRAC1ドッキングサイトがDBSのプレックストリン相同性ドメイン内に存在することを示しています。この相互作用はRAC1に特異的であり、RAC1とRho特異的グアニンヌクレオチド交換因子ファミリーの他のいくつかのメンバーの間では観察されません。活性化されたRAC1とのDBSの共発現は、NIH 3T3細胞のGTP.RHOAの焦点形成活動と上昇したレベルの増加を引き起こし、DBSが相互作用によって活性化されることを示しています。これと一致して、活性化されたRAC1はNIH 3T3細胞のDBSと共局在し、DBS発現に応じてRAC1をネイティブに発現しました。要約すると、Rho GTPaseが機能的にリンクできる驚くほど直接的なプレックストリン相同性ドメイン媒介メカニズムを特徴づけました。

Dbs is a Rho-specific guanine nucleotide exchange factor that was identified in a screen for proteins whose expression causes deregulated growth in NIH 3T3 mouse fibroblasts. Although Rac1 has not been shown to be a substrate for Dbs in either in vitro or in vivo assays, the Rat ortholog of Dbs (Ost) has been shown to bind specifically to GTP.Rac1 in vitro. The dependence of the Rac1/Dbs interaction on GTP suggests that Dbs may in fact be an effector for Rac1. Here we show that the interaction between activated Rac1 and Dbs can be recapitulated in mammalian cells and that the Rac1 docking site resides within the pleckstrin homology domain of Dbs. This interaction is specific for Rac1 and is not observed between Rac1 and several other members of the Rho-specific guanine nucleotide exchange factor family. Co-expression of Dbs with activated Rac1 causes enhanced focus forming activity and elevated levels of GTP.RhoA in NIH 3T3 cells, indicating that Dbs is activated by the interaction. Consistent with this, activated Rac1 co-localizes with Dbs in NIH 3T3 cells, and natively expressed Rac1 relocalizes in response to Dbs expression. To summarize, we have characterized a surprisingly direct pleckstrin homology domain-mediated mechanism through which Rho GTPases can become functionally linked.