メチロバクテリウム閉塞AM1およびMTDAおよび/またはFCHを欠くヌル変異体の生成のための挿入発現ベクターシステムの開発

過去数年にわたって、メチロバクテリウム閉塞AM1で使用できる遺伝的な「ツールキット」が大幅に拡大しています。ここでは、安定したマークのない染色体遺伝子座からの遺伝子の発現を可能にする挿入発現システムであるさらなる前進が提示され、実証されています。このシステムは、メチロトロフィーにおけるテトラヒドロ葉酸（H4F）経路の役割をよりよく理解するために使用されています。以前は、MTDA（NADP依存性メチレン-H4F/メチレン - テトラヒドロメタノプテリンデヒドロゲナーゼ）またはFCH（メテニルH4Fシクロヒドラーゼをコードする）のいずれかを欠くNULL変異体を生成することはできませんでした。マークのない株が生成され、類似のfold遺伝子（双方向NADP依存性メチレン-H4Fデヒドロゲナーゼ/メテニル-H4Fシクロヒドロラーゼ）を発現し、メチロバクテリウムクロロメタニカムCM4T。この株では、ヌル変異体を得ることができ、それは正常にマルチカーボン基質上で成長しましたが、C1基質の成長に欠陥がありました。さらに、MTDAおよび/またはFCHのヌル変異体は、コハク酸培地に形成を補充することにより、野生型でも生成できます。これらの株はC1化合物で成長することができませんでしたが、メタノール感受性ではありませんでした。これらのアプローチは、MTDAとFCHの明らかな本質性が、プリンおよび他の化合物の生合成のためのホルミルH4Fの必要性によるものであることを実証し、H4F経路がメチルトロフィーに必要であるという明確な遺伝的証拠を提供しています。

Over the past few years, the genetic 'toolkit' available for use with Methylobacterium extorquens AM1 has expanded significantly. Here a further advance is presented and demonstrated, an insertional expression system that allows expression of genes from a stable, unmarked chromosomal locus. This system has been used to better understand the role of the tetrahydrofolate (H4F) pathway in methylotrophy. Previously, it has not been possible to generate null mutants lacking either mtdA (encoding an NADP-dependent methylene-H4F/methylene-tetrahydromethanopterin dehydrogenase) or fch (encoding methenyl-H4F cyclohydrolase). An unmarked strain was generated that expressed the analogous folD gene (encoding a bifunctional NADP-dependent methylene-H4F dehydrogenase/methenyl-H4F cyclohydrolase) from Methylobacterium chloromethanicum CM4T. In this strain, null mutants could be obtained that grew normally on multicarbon substrates but were defective for growth on C1 substrates. Additionally, null mutants of mtdA and/or fch could also be generated in the wild-type by supplementing the succinate medium with formate. These strains were unable to grow on C1 compounds but were not methanol-sensitive. These approaches have demonstrated that the apparent essentiality of mtdA and fch is due to the need for formyl-H4F for biosynthesis of purines and other compounds, and have provided clear genetic evidence that the H4F pathway is required for methylotrophy.