6種類の細菌バイオフィルムの多重魚分析

確立された手順では、グラム陰性およびグラム陽性の細菌を使用した蛍光インsituハイブリダイゼーション（FISH）のために、異なる一見互換性のない実験プロトコルを使用します。この研究の目的は、グラム陰性およびグラム陽性経口菌の両方を含むin vitroバイオフィルムの空間組織の分析のために、魚および共焦点レーザースキャン顕微鏡（CLSM）に基づいた手順を開発することでした。6つの経口種Actinomyces naeslundii、Candida albicans、fusobacterium nucleatum、Streptococcus sobrinus、およびVeillonella disparで構成されるバイオフィルムは、サラバ酸塩症の37℃で64.5時間の64.5時間分離されました。グラム陰性菌とグラム陽性菌の両方のin situハイブリダイゼーションの同時条件は、固定とリゾチームへの曝露の体系的な変動によって求められました。固定および透過後のバイオフィルムは、16S rRNA標的オリゴヌクレオチドプローブANA103（A。naeslundiiの検出のため）、EUK116（C。albicans）、FUS664（F。核質）、MIT447およびMIT588（S。oralis）を含む魚によって標識されました。SOB174（S。Sobrinus）、およびVEI217（V。Dispar）。プローブは、6-FAM、CY3、またはCy5コンジュゲートとして使用され、標的細胞の緑、オレンジ色の赤、または深赤色の蛍光をそれぞれ使用しました。したがって、異なる蛍光タグを運ぶ3つのプローブを備えた2つの独立したトリプルハイブリダイズにより、6種すべてを視覚化できました。結果は、異なるグラム染色特性を持つ複数の細菌種で構成される複雑なバイオフィルムの魚による同時調査が可能であることを示しています。CLSMの光学断片化特性と組み合わせて、この手法は、環境の課題に応じてバイオフィルム組成の空間的変化の分析に大きな期待を抱いています。

Established procedures use different and seemingly incompatible experimental protocols for fluorescent in situ hybridization (FISH) with Gram-negative and Gram-positive bacteria. The aim of this study was to develop a procedure, based on FISH and confocal laser scanning microscopy (CLSM), for the analysis of the spatial organization of in vitro biofilms containing both Gram-negative and Gram-positive oral bacteria. Biofilms composed of the six oral species Actinomyces naeslundii, Candida albicans, Fusobacterium nucleatum, Streptococcus oralis, Streptococcus sobrinus, and Veillonella dispar were grown anaerobically for 64.5 h at 37 degrees C on hydroxyapatite disks preconditioned with saliva. Conditions for the simultaneous in situ hybridization of both Gram-negative and Gram-positive bacteria were sought by systematic variation of fixation and exposure to lysozyme. After fixation and permeabilization biofilms were labeled by FISH with 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes ANA103 (for the detection of A. naeslundii), EUK116 (C. albicans), FUS664 (F. nucleatum), MIT447 and MIT588 (S. oralis), SOB174 (S. sobrinus), and VEI217 (V. dispar). Probes were used as 6-FAM, Cy3 or Cy5 conjugates, resulting in green, orange-red or deep-red fluorescence of target cells, respectively. Thus, with two independent triple-hybridizations with three probes carrying different fluorescence-tags, all six species could be visualized. Results show that the simultaneous investigation by FISH of complex biofilms composed of multiple bacterial species with differential Gram-staining properties is possible. In combination with the optical sectioning properties of CLSM the technique holds great promise for the analysis of spatial alterations in biofilm composition in response to environmental challenges.