大腸菌クラスIAリボヌクレオチド還元酵素からの変異R1タンパク質DATP阻害に対する反応が変化した

大腸菌の好気性リボヌクレオチドレダクターゼは、クラスI酵素を含む2つのタンパク質の提案された相互作用領域に配置されたR1のアロステリック部位にエフェクターを結合することにより、その活性レベルを調節します。ATP結合により活性が増加し、DATP結合によって減少します。この調節を管理するメカニズムを研究するために、活動部位のHIS-59で突然変異を持つ3つのR1タンパク質と、活動部位に近いHIS-88で変異を持つ1つのR1タンパク質を構築し、それらのアロステリック挙動を野生の挙動と比較しました。タイプR1タンパク質。すべての変異タンパク質は、野生型酵素活性の約70％を保持していました。残基His-59をアラニンまたはアスパラギンに置き換えた場合、酵素はDATPの阻害効果に対する正常な反応を失ったのに対し、グルタミンを含む酵素は依然として正常な反応を引き出すことができたことがわかりました。His-59に水素結合に提案されている残留His-88がアラニンに置き換えられた場合、同様の結果が見られました。ヌクレオチド結合実験では、結合定数の違いが野生型および変異タンパク質で観察されなかったため、変異タンパク質がエフェクターに結合することができないためであるという可能性を排除しました。代わりに、タンパク質R1とR2の間の相互作用は、変異タンパク質で混乱しました。HIS-59は、DATP結合によってトリガーされるアロステリック効果において重要であり、HIS-59とHIS-88の間の保存された水素結合は、アロステリック効果の通信に重要であり、この効果はR1//に加えられることを提案します。R2相互作用。

Aerobic ribonucleotide reductase from Escherichia coli regulates its level of activity by binding of effectors to an allosteric site in R1, located to the proposed interaction area of the two proteins that comprise the class I enzyme. Activity is increased by ATP binding and decreased by dATP binding. To study the mechanism governing this regulation, we have constructed three R1 proteins with mutations at His-59 in the activity site and one R1 protein with a mutation at His-88 close to the activity site and compared their allosteric behavior to that of the wild type R1 protein. All mutant proteins retained about 70% of wild type enzymatic activity. We found that if residue His-59 was replaced with alanine or asparagine, the enzyme lost its normal response to the inhibitory effect of dATP, whereas the enzyme with a glutamine still managed to elicit a normal response. We saw a similar result if residue His-88, which is proposed to hydrogen-bond to His-59, was replaced with alanine. Nucleotide binding experiments ruled out the possibility that the effect is due to an inability of the mutant proteins to bind effector since little difference in binding constants was observed for wild type and mutant proteins. Instead, the interaction between proteins R1 and R2 was perturbed in the mutant proteins. We propose that His-59 is important in the allosteric effect triggered by dATP binding, that the conserved hydrogen bond between His-59 and His-88 is important for the communication of the allosteric effect, and that this effect is exerted on the R1/R2 interaction.