LNAオリゴヌクレオチドとDNAポリメラーゼおよび校正エキソヌクレアーゼ活性との相互作用における強い位置の好み：ジェノタイピングアッセイへの影響

代表的なDNAポリメラーゼおよびエキソヌクレアーゼ活性に対するロックされた核酸（LNA）修飾位置の効果は、プライマー拡張ジェノタイピングアプリケーションでの潜在的な使用について調べられています。4つの校正DNAポリメラーゼ（VENT、PFU、KLENOWフラグメントおよびT7 DNAポリメラーゼ）の3 ' - > 5'エキソヌクレアーゼ活性と、プライマーの端子（L-1）位置のLNAであるエキソヌクレアーゼIIIの場合が見つかります2つのファミリーBポリメラーゼのみのエキソヌクレアーゼに対する部分的な保護を提供する。対照的に、最後から2番目（L-2）位置のLNA残基は、本質的に完全なヌクレアーゼ耐性を生成します。これらの酵素のポリメラーゼ活性部位は、明確な好みを示します。L-1 LNA修飾はポリのマージー化に適度な影響を及ぼしますが、L-2 LNAグループはDTTPの取り込みを多少遅らせ、ターミネーターの取り込みのためにエンジニアリングされているA488LベントDNAポリメラーゼであっても、DDTTPまたはACYTTPターミネーターによる拡張を事実上廃止します。アクティブサイトの好みに関するこれらの観察結果は、エキソヌクレアーゼを介したシングルベース拡張（E-SBE）と校正対立遺伝子特異的拡張（PRASE）の2つの新しいアッセイを実証するために利用されています。L-2 LNAプライマーを使用したモデルプラゼジェノタイピング反応は、非プルフレーディング反応がLNA修飾プライマーを使用しているかどうかにかかわらず、既存の非根源アッセイよりも大きな特異性を提供することを示します。

The effect of locked nucleic acid (LNA) modification position upon representative DNA polymerase and exonuclease activities has been examined for potential use in primer extension genotyping applications. For the 3'-->5' exonuclease activities of four proofreading DNA polymerases (Vent, Pfu, Klenow fragment and T7 DNA polymerase) as well as exonuclease III, an LNA at the terminal (L-1) position of a primer is found to provide partial protection against the exonucleases of the two family B polymerases only. In contrast, an LNA residue at the penultimate (L-2) position generates essentially complete nuclease resistance. The polymerase active sites of these enzymes also display a distinct preference. An L-1 LNA modification has modest effects upon poly merization, but an L-2 LNA group slows dTTP incorporation somewhat while virtually abolishing extension with ddTTP or acyTTP terminators, even with A488L Vent DNA polymerase engineered for terminator incorporation. These observations on active site preference have been utilized to demonstrate two novel assays: exonuclease-mediated single base extension (E-SBE) and proofreading allele-specific extension (PRASE). We show that a model PRASE genotyping reaction with L-2 LNA primers offers greater specificity than existing non-proofreading assays, whether or not the non-proofreading reaction employs LNA-modified primers.