タイプIIS制限エンドヌクレアーゼBSAI、BSMBI、およびBSMAIからのエンジニアリングストランド固有のDNAニッキング酵素

さまざまな認識特異性を備えた80を超えるIIA/IIS制限エンドヌクレアーゼが現在知られています。対照的に、現在利用可能な鎖固有のニッキングエンドヌクレアーゼは限られています。この制限を克服するために、型IIS制限エンドヌクレアーゼを鎖特異的ニコンキendヌクレアーゼに変換するために、新しい遺伝的スクリーニング法を考案しました。遺伝的スクリーンは、4つのステップで構成されていました。（1）非活性化エンドヌクレアーゼ遺伝子を持つプラスミドライブラリーを作成するランダム変異誘発。（2）野生型および突然変異誘発性エンドヌクレアーゼ遺伝子を含むプラスミドの制限消化。（3）野生型N末端またはC末端フラグメントへのライゲーションにより、野生型遺伝子とのバッククロス。（4）結紮DNAの事前に修正された宿主への変換と、形質転換体の全細胞培養または細胞抽出物におけるエンドヌクレアーゼ活性のニッキングのためのスクリーニング。Nt.bsaiおよびnb.bsaiのニックキングエンドヌクレアーゼは、この遺伝的スクリーンを使用してBsaiから分離されました。さらに、最小限の二本鎖DNA切断活性を備えたBsaiニックキングバリアントを分離するために、部位指向の突然変異誘発を実施しました。同等のアミノ酸置換は、同様の認識シーケンスと有意なアミノ酸配列同一性を持つBSMBIおよびBSMAI制限エンドヌクレアーゼに導入され、そのニックバリアントは正常に分離されました。この作業は、一部のタイプIIS制限エンドヌクレアーゼが2つの別々のアクティブサイトを運ぶという強力な証拠を提供します。活性部位の1つが不活性化されている場合、IISのタイプ制限エンドヌクレアーゼは、1つの鎖のみをニックする可能性があります。

More than 80 type IIA/IIS restriction endonucleases with different recognition specificities are now known. In contrast, only a limited number of strand-specific nicking endonucleases are currently available. To overcome this limitation, a novel genetic screening method was devised to convert type IIS restriction endonucleases into strand-specific nicking endonucleases. The genetic screen consisted of four steps: (1) random mutagenesis to create a plasmid library, each bearing an inactivated endonuclease gene; (2) restriction digestion of plasmids containing the wild-type and the mutagenized endonuclease gene; (3) back-crosses with the wild-type gene by ligation to the wild-type N-terminal or C-terminal fragment; (4) transformation of the ligated DNA into a pre-modified host and screening for nicking endonuclease activity in total cell culture or cell extracts of the transformants. Nt.BsaI and Nb.BsaI nicking endonucleases were isolated from BsaI using this genetic screen. In addition, site-directed mutagenesis was carried out to isolate BsaI nicking variants with minimal double-stranded DNA cleavage activity. The equivalent amino acid substitutions were introduced into BsmBI and BsmAI restriction endonucleases with similar recognition sequence and significant amino acid sequence identity and their nicking variants were successfully isolated. This work provides strong evidence that some type IIS restriction endonucleases carry two separate active sites. When one of the active sites is inactivated, the type IIS restriction endonuclease may nick only one strand.