複製T4 DNAポリメラーゼの3'-5 'エキソヌクレアーゼの不活性化により、ABASIC部位でトランスレオンDNA合成が可能になります

ここでは、モデルDNA基質上にある単一の虐待部位を過ぎて伸ばす複製T4 DNAポリメラーゼ（GP43）の能力に及ぼす校正エキソヌクレアーゼ機能の喪失の結果を調査しました。我々の結果は、野生型T4 DNAポリメラーゼが異なる配列を持つ2つの線形基質の病変に先行する塩基で停止したのに対し、GP43 D219Aエキソヌクレアーゼ欠損変異体は、同じ基板を複製するときに効率的なバイパスを可能にすることを示しています。DNAテンプレートの構造は、エキソヌクレアーゼにぴったりのまたは不足しているT4 DNAポリメラーゼの挙動に影響を与えませんでした。実際、線形DNAの1つの循環によって構築された損傷した「ミニサルコ」DNA基質を複製すると、野生型酵素による伸長はABASIC部位によって完全にブロックされましたが、D219A変異体はバイパスできました。DNA複製中、T4 DNAポリメラーゼは、組み合わせた作用によりポリメラーゼ結合能力と加工性が増加するアクセサリー因子と関連付けられ、酵素の挙動が虐待部位に向かって調節される可能性があります。したがって、これらの複製型アクセサリータンパク質と併せて、野生型およびエキソヌクレアーゼ欠損T4 DNAポリメラーゼの能力を測定する実験を行い、線形または円形の損傷したDNA基質にトランスリンションDNA複製を実行しました。アクセサリ因子の添加後のT4 DNAポリメラーゼの野生型およびエキソヌクレアーゼ欠損型のバイパス活性の刺激または阻害の証拠は見つかりませんでした。T4 DNAポリメラーゼによるABASIC部位のトランスレオン合成を決定する。

Here, we have investigated the consequences of the loss of proof-reading exonuclease function on the ability of the replicative T4 DNA polymerase (gp43) to elongate past a single abasic site located on model DNA substrates. Our results show that wild-type T4 DNA polymerase stopped at the base preceding the lesion on two linear substrates having different sequences, whereas the gp43 D219A exonuclease-deficient mutant was capable of efficient bypass when replicating the same substrates. The structure of the DNA template did not influence the behavior of the exonuclease-proficient or deficient T4 DNA polymerases. In fact, when replicating a damaged "minicircle" DNA substrate constructed by circularizing one of the linear DNA, elongation by wild-type enzyme was still completely blocked by the abasic site, while the D219A mutant was capable of bypass. During DNA replication, the T4 DNA polymerase associates with accessory factors whose combined action increases the polymerase-binding capacity and processivity, and could modulate the behavior of the enzyme towards an abasic site. We thus performed experiments measuring the ability of wild-type and exonuclease-deficient T4 DNA polymerases, in conjunction with these replicative accessory proteins, to perform translesion DNA replication on linear or circular damaged DNA substrates. We found no evidence of either stimulation or inhibition of the bypass activities of the wild-type and exonuclease-deficient forms of T4 DNA polymerase following addition of the accessory factors, indicating that the presence or absence of the proof-reading activity is the major determinant in dictating translesion synthesis of an abasic site by T4 DNA polymerase.